Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljše rezultate priporočamo, da uporabite novejšo različico brskalnika (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem, da bi zagotovili stalno podporo, spletno mesto prikazujemo brez stiliziranja ali JavaScripta.
Rast mikrobov v ranah se pogosto kaže kot biofilmi, ki motijo celjenje in jih je težko izkoreniniti. Novi srebrni povoji trdijo, da se borijo proti okužbam ran, vendar njihova učinkovitost proti biofilmu in učinki celjenja, neodvisni od okužbe, na splošno niso znani. Z uporabo in vitro in in vivo modelov biofilma Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa poročamo o učinkovitosti povojev, ki ustvarjajo ione Ag1+; povojev Ag1+, ki vsebujejo etilendiamintetraocetno kislino in benzetonijev klorid (Ag1+/EDTA/BC), ter povojev, ki vsebujejo srebrov nitrat (Ag oksisoli), ki proizvajajo ione Ag1+, Ag2+ in Ag3+ za boj proti biofilmu rane in njegovemu vplivu na celjenje. Povoji Ag1+ so imeli minimalen učinek na biofilm rane in vitro in pri miših (C57BL/6j). Nasprotno pa so oksigenirane Ag soli in povoji Ag1+/EDTA/BC znatno zmanjšali število živih bakterij v biofilmih in vitro ter pokazali znatno zmanjšanje bakterijskih in EPS komponent v biofilmih mišjih ran. Ti povoji so imeli različne učinke na celjenje ran, okuženih z biofilmom, in ran, ki niso bile okužene z biofilmom, pri čemer so imeli povoji s oksigenirano soljo ugodnejše učinke na reepitelizacijo, velikost rane in vnetje v primerjavi s kontrolnimi zdravljenji in drugimi srebrnimi povoji. Različne fizikalno-kemijske lastnosti srebrnih povojev imajo lahko različne učinke na biofilm rane in celjenje, kar je treba upoštevati pri izbiri povoja za zdravljenje ran, okuženih z biofilmom.
Kronične rane so opredeljene kot »rane, ki ne napredujejo skozi normalne faze celjenja na urejen in pravočasen način«1. Kronične rane ustvarjajo psihološko, socialno in ekonomsko breme za bolnike in zdravstveni sistem. Letni izdatki NHS za zdravljenje ran in z njimi povezanih sočasnih bolezni so v obdobju 2017–2018 ocenjeni na 8,3 milijarde funtov2. Kronične rane so trenutno pereč problem tudi v Združenih državah Amerike, saj Medicare ocenjuje letne stroške zdravljenja bolnikov z ranami na 28,1–96,8 milijarde dolarjev3.
Okužba je glavni dejavnik, ki preprečuje celjenje ran. Okužbe se pogosto kažejo kot biofilmi, ki so prisotni v 78 % kroničnih ran, ki se ne celijo. Biofilmi nastanejo, ko se mikroorganizmi nepovratno pritrdijo na površine, kot so površine ran, in se lahko združijo v združbe, ki proizvajajo zunajcelične polimere (EPS). Biofilm rane je povezan s povečanim vnetnim odzivom, ki vodi do poškodb tkiva, kar lahko odloži ali prepreči celjenje4. Povečanje poškodb tkiva je lahko delno posledica povečane aktivnosti matričnih metaloproteinaz, kolagenaze, elastaze in reaktivnih kisikovih spojin5. Poleg tega so vnetne celice in biofilmi sami po sebi veliki porabniki kisika in lahko zato povzročijo lokalno hipoksijo tkiva, kar celicam odvzame vitalni kisik, potreben za učinkovito obnovo tkiva6.
Zreli biofilmi so zelo odporni na protimikrobna sredstva, kar zahteva agresivne strategije za nadzor okužb z biofilmi, kot je mehanska obdelava, ki ji sledi učinkovito protimikrobno zdravljenje. Ker se biofilmi lahko hitro regenerirajo, lahko učinkovita protimikrobna sredstva zmanjšajo tveganje za ponovno nastanek po kirurškem odstranjevanju ran7.
Srebro se vse pogosteje uporablja v protimikrobnih oblogah in se pogosto uporablja kot zdravilo prve izbire za kronično okužene rane. Na trgu je veliko komercialno dostopnih srebrnih oblog, od katerih vsak vsebuje drugačno sestavo, koncentracijo in osnovno matrico srebra. Napredek pri srebrnih oblogah je privedel do razvoja novih srebrnih oblog. Kovinska oblika srebra (Ag0) je inertna; da doseže protimikrobno učinkovitost, mora izgubiti elektron, da tvori ionsko srebro (Ag1+). Tradicionalne srebrne obloge vsebujejo srebrove spojine ali kovinsko srebro, ki se ob stiku s tekočino razgradijo in tvorijo ione Ag1+. Ti ioni Ag1+ reagirajo z bakterijsko celico in odstranjujejo elektrone iz strukturnih komponent ali kritičnih procesov, potrebnih za preživetje. Patentirana tehnologija je privedla do razvoja nove srebrne spojine, Ag oksisoli (srebrov nitrat, Ag7NO11), ki je vključena v obloge za rane. Za razliko od tradicionalnega srebra razgradnja soli, ki vsebujejo kisik, povzroči stanja srebra z višjo valenco (Ag1+, Ag2+ in Ag3+). Študije in vitro so pokazale, da so nizke koncentracije oksigeniranih srebrovih soli učinkovitejše od enojnih ionov srebra (Ag1+) proti patogenim bakterijam, kot so Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus in Escherichia coli8,9. Druga nova vrsta srebrnih oblog vključuje dodatne sestavine, in sicer etilendiamintetraocetno kislino (EDTA) in benzetonijev klorid (BC), za katera je bilo ugotovljeno, da ciljata na biofilm EPS in s tem povečata prodiranje srebra v biofilm. Te nove tehnologije srebra ponujajo nove načine za ciljanje biofilmov ran. Vendar pa je vpliv teh protimikrobnih sredstev na okolje rane in celjenje, neodvisno od okužbe, pomemben za zagotovitev, da ne ustvarijo neugodnega okolja rane ali upočasnijo celjenja. Poročali so o pomislekih glede citotoksičnosti srebra in vitro pri več srebrnih oblogah10,11. Vendar se citotoksičnost in vitro še ni prenesla v toksičnost in vivo, več oblog Ag1+ pa je pokazalo dober varnostni profil12.
V tej raziskavi smo raziskali učinkovitost karboksimetilceluloznih oblog, ki vsebujejo nove formulacije srebra, proti biofilmu ran in vitro in in vivo. Poleg tega smo ocenili učinke teh oblog na imunski odziv in celjenje neodvisno od okužbe.
Vsi uporabljeni povoji so bili komercialno dostopni. 3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M, Knutsford, Združeno kraljestvo) je neantimikrobni 100-odstotni karboksimetilcelulozni (CMC) gel vlaknasti povoj, ki je bil v tej študiji uporabljen kot kontrolni povoj. Ocenjeni so bili trije antimikrobni CMC srebrni povoji, in sicer 3M Kerracel Ag povoj (3M, Knutsford, Združeno kraljestvo), ki vsebuje 1,7 mas. % oksigenirane srebrove soli (Ag7NO11) v srebrovih ionih z višjo valenco (Ag1+, Ag2+ in Ag3+). Med razgradnjo Ag7NO11 nastajajo ioni Ag1+, Ag2+ in Ag3+ v razmerju 1:2:4. Obloga Aquacel Ag Extra, ki vsebuje 1,2 % srebrovega klorida (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, Združeno kraljestvo) 13 in obloga Aquacel Ag + Extra, ki vsebuje 1,2 % srebrovega klorida (Ag1+), EDTA in benzetonijev klorid (ConvaTec, Deeside, Združeno kraljestvo) 14.
V tej študiji sta bila uporabljena seva Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) in Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bakterije smo gojili čez noč v Muller-Hintonovem bujonu (Oxoid, Altrincham, Združeno kraljestvo). Nočno kulturo smo nato razredčili v razmerju 1:100 v Mueller-Hintonovem bujonu in 200 µl nanesli na sterilne 0,2 µm Whatmanove cikloporne membrane (Whatman plc, Maidstone, Združeno kraljestvo) na Mueller-Hintonove agar plošče (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Velika Britanija). Nastanek kolonialnih biofilmov pri 37 °C 24 ur. Ti kolonialni biofilmi so bili testirani na logaritemsko krčenje.
Oblogo narežite na kvadratne kose velikosti 3 cm2 in jih predhodno navlažite s sterilno deionizirano vodo. Povoj položite čez biofilm kolonije na agar plošči. Vsakih 24 ha biofilma je bilo odstranjenih in žive bakterije v biofilmu (CFU/ml) so bile kvantificirane s serijskim redčenjem (10−1 do 10−7) v nevtralizacijski juhi Day-Angle (Merck-Millipore). Po 24 urah inkubacije pri 37 °C so bile izvedene standardne vrednosti štetja na ploščah na agar ploščah Mueller-Hinton. Vsaka obdelava in časovna točka sta bili izvedeni v treh ponovitvah, vrednosti štetja na ploščah pa so bile ponovljene za vsako redčenje.
Koža svinjskega trebuha je bila pridobljena od samic velikih belih prašičev v 15 minutah po zakolu v skladu z izvoznimi standardi Evropske unije. Koža je bila obrita in očiščena z alkoholnimi robčki, nato pa zamrznjena pri -80 °C za 24 ur, da se je koža devitalizirala. Po odtajanju so bili 1 cm2 koščki kože trikrat oprani s PBS, 0,6 % natrijevim hipokloritom in 70 % etanolom, vsakič po 20 minut. Pred odstranitvijo povrhnjice je bil preostali etanol odstranjen s trikratnim spiranjem v sterilnem PBS. Koža je bila gojena v 6-vdolbinski plošči z 0,45 μm debelo najlonsko membrano (Merck-Millipore) na vrhu in 3 vpojnimi blazinicami (Merck-Millipore), ki so vsebovale 3 ml fetalnega govejega seruma (Sigma), dopolnjenega z 10 % Dulbeccovega modificiranega Eagleovega medija (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Kolonialni biofilmi so bili vzgojeni, kot je opisano za študije izpostavljenosti biofilmu. Po 72-urnem gojenju biofilma na membrani je bil biofilm nanesen na površino kože s sterilno inokulacijsko zanko, membrana pa je bila odstranjena. Biofilm je bil nato inkubiran na prašičjem dermisu dodatnih 24 ur pri 37 °C, da je biofilm dozorel in se prilepil na prašičjo kožo. Ko je biofilm dozorel in se pritrdil, je bil na površino kože neposredno nanesen 1,5 cm2 velik povoj, predhodno navlažen s sterilno destilirano vodo, in inkubiran pri 37 °C 24 ur. Žive bakterije so bile vizualizirane z barvanjem z enakomernim nanosom reagenta za viabilnost celic PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Združeno kraljestvo) na apikalno površino vsakega eksplantata in inkubacijo 5 minut. Za takojšnje zajemanje slik na mikroskopu Leica MZ8 uporabite digitalni fotoaparat Leica DFC425. Rožnato obarvana območja so bila kvantificirana z uporabo programske opreme Image Pro različice 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). Vrstična elektronska mikroskopija je bila izvedena, kot je opisano spodaj.
Bakterije, vzgojene čez noč, smo razredčili v razmerju 1:100 v Mueller-Hintonovem bujonu. 200 μl kulture smo dodali na sterilno 0,2 μm Whatman cyclopore membrano (Whatman, Maidstone, Združeno kraljestvo) in nasadili na Mueller-Hintonov agar. Plošče z biofilmom smo inkubirali pri 37 °C 72 ur, da smo omogočili nastanek zrelega biofilma.
Po 3 dneh zorenja biofilma je bil na biofilm neposredno nameščen 3 cm2 kvadratni povoj in inkubiran pri 37 °C 24 ur. Po odstranitvi povoja s površine biofilma je bil na površino vsakega biofilma za 20 sekund dodan 1 ml reagenta za preživetje celic PrestoBlue (Invitrogen, Waltham, MA). Površine so bile posušene, preden so bile spremembe barve zabeležene z digitalnim fotoaparatom Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Združeno kraljestvo).
Pripravite nočne kulture na Mueller-Hintonovem agarju, posamezne kolonije prenesite v 10 ml Mueller-Hintonove juhe in inkubirajte na stresalniku pri 37 °C (100 vrt/min). Po nočni inkubaciji je bila kultura razredčena v razmerju 1:100 v Mueller-Hintonovi juhi in 300 µl je bilo nanesenih na 0,2 µm krožno Whatmanovo cikloporno membrano (Whatman International, Maidstone, Združeno kraljestvo) na Mueller-Hintonovem agarju ter inkubirana pri 37 °C v 72 urah. Zreli biofilm je bil nanesen na rano, kot je opisano spodaj.
Vse delo z živalmi je bilo opravljeno na Univerzi v Manchestru v skladu s projektno licenco, ki jo je odobril Urad za dobro počutje živali in etični pregled (P8721BD27), in v skladu s smernicami, ki jih je objavilo Ministrstvo za notranje zadeve v skladu z revidiranim zakonom ASPA iz leta 2012. Vsi avtorji so se držali smernic za prihod. Za vse študije in vivo so bile uporabljene osem tednov stare miši C57BL/6j (Envigo, Oxon, Združeno kraljestvo). Miši so bile anestezirane z izofluranom (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Združeno kraljestvo), njihove hrbtne površine pa so bile obrite in očiščene. Vsaki miši je bila nato z uporabo Stiefel biopsijskega luknjača (Schuco International, Hertfordshire, Združeno kraljestvo) narejena ekscizijska rana velikosti 2 × 6 mm. Pri ranah, okuženih z biofilmom, je treba na dermalno plast rane s sterilno inokulacijsko zanko takoj po poškodbi nanesti 72-urni kolonialni biofilm, vzgojen na membrani, kot je opisano zgoraj, in membrano zavreči. En kvadratni centimeter obloge je predhodno navlažen s sterilno vodo, da se ohrani vlažno okolje rane. Povoji so bili naneseni neposredno na vsako rano in prekriti s filmom 3M Tegaderm (3M, Bracknell, Združeno kraljestvo) in tekočim lepilom Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI), nanesenim okoli robov, da se zagotovi dodatna adhezija. Buprenorfin (Animalcare, York, Združeno kraljestvo) je bil uporabljen v koncentraciji 0,1 mg/kg kot analgetik. Miši so bile izločene tri dni po poškodbi z metodo iz Priloge 1 ter po potrebi odstranjene, prepolovljene in shranjene predele rane.
Barvanje s hematoksilinom (ThermoFisher Scientific) in eozinom (ThermoFisher Scientific) je bilo izvedeno v skladu s protokolom proizvajalca. Površina rane in reepitelizacija sta bili kvantificirani z uporabo programske opreme Image Pro različice 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Tkivne rezine so bile razvoskane v ksilenu (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Združeno kraljestvo), rehidrirane s 100–50 % etanolom in na kratko potopljene v deionizirano vodo (ThermoFisher Scientific). Imunohistokemija je bila izvedena z uporabo kompleta VectaStain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornija) v skladu s protokolom proizvajalca. Primarna protitelesa proti nevtrofilcem NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) in makrofagom Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Združeno kraljestvo) so bila razredčena v razmerju 1:100 v blokirni raztopini in dodana na prerezano površino, nato pa sta bila dodana še 2 protitelesa: anti-, VectaStain ABC in komplet substrata Vector Nova Red Peroxidase (HRP) (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornija) ter kontrastno obarvana s hematoksilinom. Slike so bile pridobljene z mikroskopom Olympus BX43 in digitalnim fotoaparatom Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Združeno kraljestvo).
Vzorce kože smo fiksirali v 2,5 % glutaraldehidu in 4 % formaldehidu v 0,1 M HEPES (pH 7,4) 24 ur pri 4 °C. Vzorce smo dehidrirali z uporabo stopnjevanega etanola in posušili v CO2 z uporabo sušilnika kritičnih točk Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Združeno kraljestvo) ter nanje nanesli zlato-paladijevo zlitino z uporabo mini razpršilnega/žarilnega sistema Quorum SC7620. Vzorce smo slikali z vrstičnim elektronskim mikroskopom FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) za vizualizacijo osrednje točke rane.
Na izrezano površino mišje rane smo nanesli toto-1 jodid (2 μM) in inkubirali 5 minut pri 37 °C (ThermoFisher Scientific) ter obdelali s Syto-60 (10 μM) pri 37 °C (ThermoFisher Scientific). 15-minutne Z-stack slike smo ustvarili z uporabo Leica TCS SP8.
Biološki in tehnični podatki o ponovitvah so bili tabelarično prikazani in analizirani z uporabo programske opreme Graphpad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornija). Za preverjanje razlik med posameznimi zdravljenji in kontrolno oblogo brez antimikrobnih sredstev je bila uporabljena enosmerna analiza variance z večkratnimi primerjavami z uporabo Dunnettovega post hoc testa. Vrednost p < 0,05 je bila ocenjena kot pomembna.
Učinkovitost vlaknastih oblog iz srebrnega gela je bila najprej ocenjena proti kolonijam biofilma Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa in vitro. Srebrne obloge vsebujejo različne formule srebra: tradicionalne srebrne obloge proizvajajo ione Ag1+; srebrne obloge, ki lahko po dodatku EDTA/BC proizvajajo ione Ag1+, lahko uničijo matrico biofilma in izpostavijo bakterije srebru pod antibakterijskim učinkom srebrovih ionov15 in obloge, ki vsebujejo oksigenirane soli Ag, ki proizvajajo ione Ag1+, Ag2+ in Ag3+. Njihova učinkovitost je bila primerjana z neantimikrobno kontrolno oblogo, izdelano iz geliranih vlaken. Preostale sposobne bakterije v biofilmu so bile ocenjene vsakih 24 ur 8 dni (slika 1). 5. dan je bil biofilm ponovno inokuliran s 3,85 × 105S Staphylococcus aureus ali 1,22 × 105P. aeruginosa, da bi ocenili okrevanje biofilma. V primerjavi z neantimikrobnimi kontrolnimi oblogami so obloge z Ag1+ imele minimalen vpliv na preživetje bakterij v biofilmih Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa v 5 dneh. Nasprotno pa so bile obloge, ki so vsebovale oksigenirano Ag in Ag1+ + soli EDTA/BC, učinkovite pri uničevanju bakterij v biofilmu v 5 dneh. Po ponovni inokulaciji s planktonskimi bakterijami 5. dan ni bilo opaziti obnove biofilma (slika 1).
Kvantifikacija živih bakterij v biofilmih Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa po zdravljenju s srebrnimi oblogami. Kolonije biofilmov Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa so bile zdravljene s srebrnimi oblogami ali kontrolnimi oblogami brez antimikrobnih snovi, število preostalih živih bakterij pa je bilo določeno vsakih 24 ur. Po 5 dneh je bil biofilm ponovno inokuliran s 3,85 × 105S. Staphylococcus aureus ali 1,22 × 105P. Kolonije bakterioplanktona Pseudomonas aeruginosa so bile oblikovane posamično za oceno okrevanja biofilma. Grafi prikazujejo povprečje +/- standardno napako.
Za vizualizacijo učinka srebrnih oblog na sposobnost preživetja biofilma so bile obloge nanesene na zrele biofilme, vzgojene na koži prašiča ex vivo. Po 24 urah se obloga odstrani in biofilm se obarva z modrim reaktivnim barvilom, ki ga žive bakterije presnovijo v rožnato barvo. Biofilmi, obdelani s kontrolnimi oblogami, so bili rožnati, kar kaže na prisotnost živih bakterij v biofilmu (slika 2A). Nasprotno pa je bil biofilm, obdelan s oblogo Ag oxysols, pretežno moder, kar kaže na to, da so bile preostale bakterije na površini prašičje kože neživih bakterij (slika 2B). Pri biofilmih, obdelanih s oblogami, ki vsebujejo Ag1+, je bila opažena mešana modra in rožnata obarvanost, kar kaže na prisotnost živih in neživih bakterij v biofilmu (slika 2C), medtem ko so bile obloge EDTA/BC, ki vsebujejo Ag1+, pretežno modre z nekaj rožnatimi pikami, kar kaže na območja, na katera srebrna obloga ni vplivala (slika 2D). Kvantifikacija aktivnih (rožnatih) in neaktivnih (modrih) območij je pokazala, da je bil kontrolni obliž 75 % aktiven (slika 2E). Obloge Ag1+ + EDTA/BC so se obnesle podobno kot obloge s oksigeniranimi srebrnimi solmi, s stopnjo preživetja 13 % oziroma 14 %. Obloga Ag1+ je prav tako zmanjšala sposobnost preživetja bakterij za 21 %. Te biofilme so nato opazovali z vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM). Po zdravljenju s kontrolno oblogo in oblogo Ag1+ je bila na koži prašiča opažena plast Pseudomonas aeruginosa (slika 2F,H), medtem ko je bilo po zdravljenju z oblogo Ag1+ najdenih le malo bakterijskih celic in le malo bakterijskih celic pod njimi. Kolagena vlakna lahko štejemo za tkivno strukturo kože prašiča (slika 2G). Po zdravljenju z oblogo Ag1+ + EDTA/BC so bili vidni bakterijski plaki in plaki kolagenih vlaken pod njimi (slika 2I).
Vizualizacija biofilma Pseudomonas aeruginosa po obdelavi s srebrnim povojem. (A–D) Bakterijska sposobnost preživetja v biofilmih Pseudomonas aeruginosa, vzgojenih na prašičji koži, je bila vizualizirana z uporabo barvila PrestoBlue za preživetje 24 ur po obdelavi s srebrnimi povoji ali kontrolnimi povoji brez antimikrobnih snovi. Žive bakterije so rožnate, neaktivne bakterije in prašičja koža pa modre. (E) Kvantifikacija biofilmov Pseudomonas aeruginosa, vzgojenih na prašičji koži (rožnata lisa), z uporabo vrstične elektronske mikroskopije Image Pro različice 10 (FI) in obdelanih s srebrnim povojem ali kontrolnim povojem brez antimikrobnih snovi 24 ur. Merilo SEM = 5 µm. (J–M) Kolonialni biofilmi so rasli na filtrih in so bili po 24 urah inkubacije s srebrnimi povoji obarvani z reaktivnim barvilom PrestoBlue.
Da bi ugotovili, ali tesen stik med oblogami in biofilmi vpliva na učinkovitost oblog, so kolonialne biofilme, nameščene na ravno površino, 24 ur obdelali s oblogami in nato obarvali z reaktivnimi barvili. Neobdelani biofilm je bil temno rožnate barve (slika 2J). V nasprotju z biofilmi, obdelanimi s oblogami, ki vsebujejo oksigenirane soli Ag (slika 2K), so biofilmi, obdelani s oblogami, ki vsebujejo Ag1+ ali Ag1+ + EDTA/BC, pokazali rožnate obarvanja (slika 2L,M). Ta rožnata obarvanost kaže na prisotnost živih bakterij in je povezana z območjem šiva znotraj obloge. Ta zašita območja ustvarjajo mrtve prostore, ki omogočajo preživetje bakterij znotraj biofilma.
Za oceno učinkovitosti srebrnih oblog in vivo so bile rane miši, okuženih z zrelimi biofilmi S. aureus in P. aeruginosa, ki so bile v polni debelini izrezane, zdravljene z neantimikrobnimi kontrolnimi oblogami ali srebrnimi oblogami. Po 3 dneh zdravljenja je makroskopska analiza slike pokazala manjše velikosti ran pri zdravljenju s oksigeniranimi solnimi oblogami v primerjavi z neantimikrobnimi kontrolnimi oblogami in drugimi srebrnimi oblogami (slika 3A-H). Za potrditev teh opažanj so bile rane odvzete, površina rane in reepitelizacija pa sta bili kvantificirani na tkivnih rezinah, obarvanih s hematoksilinom in eozinom, z uporabo programske opreme Image Pro različice 10 (slika 3I-L).
Učinek srebrnih oblog na površino rane in reepitelizacija ran, okuženih z biofilmi. (A–H) Majhne celice, okužene z biofilmi Pseudomonas aeruginosa (A–D) in Staphylococcus aureus (E–H) po treh dneh zdravljenja z neantimikrobno kontrolno oblogo, oblogo s oksigenirano Ag soljo, oblogo Ag1+ in oblogo Ag1+. Reprezentativne makroskopske slike. Rane miši z oblogo Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Reprezentativna okužba s Pseudomonas aeruginosa, histološki prerezi, obarvani s hematoksilinom in eozinom, uporabljeni za kvantifikacijo površine rane in regeneracije epitelija. Kvantifikacija površine rane (M, O) in odstotka reepitelizacije (N, P) ran, okuženih z biofilmi Pseudomonas aeruginosa (M, N) in Staphylococcus aureus (O, P) (na tretirano skupino n = 12). Grafi prikazujejo povprečje +/- standardno napako. * pomeni p = < 0,05 ** pomeni p = < 0,01; Makroskopsko merilo = 2,5 mm, histološko merilo = 500 µm.
Kvantifikacija površine rane pri ranah, okuženih z biofilmom Pseudomonas aeruginosa (slika 3M), je pokazala, da so imele rane, zdravljene z Ag oksisolmi, povprečno velikost rane 2,5 mm2, medtem ko je imela kontrolna obloga brez antimikrobnih sredstev povprečno velikost rane 3,1 mm2, kar ne drži. To je doseglo statistično značilnost (slika 3M). p = 0,423). Rane, zdravljene z Ag1+ ali Ag1+ + EDTA/BC, niso pokazale zmanjšanja površine rane (3,1 mm2 oziroma 3,6 mm2). Zdravljenje s oksigenirano oblogo s Ag soljo je v večji meri spodbudilo ponovno epitelizacijo kot kontrolna obloga brez antimikrobnih sredstev (34 % oziroma 15 %; p = 0,029) in Ag1+ ali Ag1+ + EDTA/BC (10 % oziroma 11 %) (slika 3N).
Podobni trendi v površini rane in regeneraciji epitelija so bili opaženi pri ranah, okuženih z biofilmi S. aureus (slika 3O). Obloge, ki vsebujejo oksigenirane srebrove soli, so zmanjšale površino rane (2,0 mm2) za 23 % v primerjavi s kontrolno neantimikrobno oblogo (2,6 mm2), čeprav to zmanjšanje ni bilo pomembno (p = 0,304) (slika 3O). Poleg tega se je površina rane v skupini, zdravljeni z Ag1+, nekoliko zmanjšala (2,4 mm2), medtem ko rana, zdravljena s oblogo Ag1+ + EDTA/BC, ni zmanjšala površine rane (2,9 mm2). Kisikove soli Ag so prav tako v večji meri spodbudile ponovno epitelizacijo ran, okuženih z biofilmom S. aureus (31 %), kot tiste, zdravljene s kontrolnimi oblogami brez antimikrobnih snovi (12 %, p = 0,003) (slika 3P). Obloga Ag1+ (16 %, p = 0,903) in obloga Ag+1 + EDTA/BC (14 %, p = 0,965) sta pokazala podobno raven regeneracije epitelija kot pri kontrolni skupini.
Za vizualizacijo učinka srebrnih oblog na matrico biofilma je bilo izvedeno barvanje z jodidom Toto 1 in Syto 60 (slika 4). Jodid Toto 1 je barvilo, neprepustno za celice, ki se lahko uporabi za natančno vizualizacijo zunajceličnih nukleinskih kislin, ki so v izobilju v EPS biofilmih. Syto 60 je barvilo, prepustno za celice, ki se uporablja kot kontrastno barvilo16. Opazovanja jodida Toto 1 in Syto 60 v ranah, inokuliranih z biofilmi Pseudomonas aeruginosa (slika 4A-D) in Staphylococcus aureus (slika 4I-L), so pokazala, da se je po 3 dneh zdravljenja z oblogo EPS v biofilmu znatno zmanjšal. Obloge Ag1+ brez dodatnih antibiotičnih komponent biofilma so znatno zmanjšale prostocelično DNA v ranah, inokuliranih s Pseudomonas aeruginosa, vendar so bile manj učinkovite pri ranah, inokuliranih s Staphylococcus aureus.
In vivo slikanje biofilma rane po 3 dneh zdravljenja s kontrolnimi ali srebrnimi oblogami. Konfokalne slike Pseudomonas aeruginosa (A–D) in Staphylococcus aureus (I–L), obarvanih s Toto 1 (zeleno), za vizualizacijo zunajceličnih nukleinskih kislin, ki so sestavni del polimerov zunajceličnega biofilma. Za barvanje znotrajceličnih nukleinskih kislin uporabite Syto 60 (rdeče). kisline. P. Vrstična elektronska mikroskopija ran, okuženih z biofilmi Pseudomonas aeruginosa (E–H) in Staphylococcus aureus (M–P), po 3 dneh zdravljenja s kontrolnimi in srebrnimi oblogami. Merilo SEM = 5 µm. Merilo konfokalnega slikanja = 50 µm.
Vrstična elektronska mikroskopija je pokazala, da so imele miši, cepljene z biofilmskimi kolonijami Pseudomonas aeruginosa (slika 4E-H) in Staphylococcus aureus (slika 4M-P), po 3 dneh zdravljenja z vsemi srebrnimi oblogami bistveno manj bakterij v ranah.
Za oceno učinka srebrnih oblog na vnetje ran pri miših, okuženih z biofilmom, so bili odseki ran, okuženih z biofilmom, ki so bili 3 dni zdravljeni s kontrolnimi ali srebrnimi oblogami, imunohistokemično obarvani z uporabo protiteles, specifičnih za nevtrofilce in makrofage. Kvantitativna določitev nevtrofilcev in makrofagov znotraj. granulacijsko tkivo. Slika 5). Vse srebrne obloge so po treh dneh zdravljenja zmanjšale število nevtrofilcev in makrofagov v ranah, okuženih s Pseudomonas aeruginosa, v primerjavi s kontrolnimi oblogami brez antimikrobnih sredstev. Vendar pa je zdravljenje s oblogo s oksigenirano srebrno soljo povzročilo večje zmanjšanje nevtrofilcev (p = <0,0001) in makrofagov (p = <0,0001) v primerjavi z drugimi testiranimi srebrnimi oblogami (slika 5I,J). Čeprav je imel Ag1+ + EDTA/BC večji učinek na biofilm rane, je v manjši meri zmanjšal raven nevtrofilcev in makrofagov kot obloga Ag1+. Zmerne rane, okužene z biofilmom S. aureus, so bile opažene tudi po oblogah z oksidoli Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) in Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) v primerjavi s kontrolno skupino. Podobni trendi so opaženi pri nevtropeničnem povoju (slika 5K). Vendar pa je le obloga s oksigenirano srebrno soljo pokazala znatno zmanjšanje števila makrofagov v granulacijskem tkivu v primerjavi s kontrolno skupino pri ranah, okuženih z biofilmi S. aureus (p = 0,0339) (slika 5L).
Nevtrofilci in makrofagi so bili kvantificirani v ranah, okuženih z biofilmi Pseudomonas aeruginosa in Staphylococcus aureus, po 3 dneh zdravljenja z neantimikrobnimi kontrolnimi ali srebrnimi oblogami. Nevtrofilci (AD) in makrofagi (EH) so bili kvantificirani v tkivnih rezinah, obarvanih s protitelesi, specifičnimi za nevtrofilce ali makrofage. Kvantifikacija nevtrofilcev (I in K) in makrofagov (J in L) v ranah, okuženih z biofilmi Pseudomonas aeruginosa (I in J) in Staphylococcus aureus (K in L). N = 12 na skupino. Grafi prikazujejo povprečje +/- standardno napako, vrednosti pomembnosti v primerjavi z neantibakterijsko kontrolno oblogo, * pomeni p = < 0,05, ** pomeni p = < 0,01; *** pomeni p = < 0,001; označuje p = < 0,0001).
Nato smo ocenili učinek srebrnih oblog na celjenje, neodvisno od okužbe. Neokužene ekscizijske rane smo 3 dni zdravili s kontrolno oblogo brez antimikrobnih snovi ali s srebrno oblogo (slika 6). Med testiranimi srebrnimi oblogami so bile le rane, zdravljene s oblogo s oksigenirano soljo, na makroskopskih slikah videti manjše kot rane, zdravljene s kontrolno skupino (slika 6A-D). Kvantifikacija površine rane z uporabo histološke analize je pokazala, da je bila povprečna površina rane po zdravljenju s oblogo Ag oxysols 2,35 mm2 v primerjavi z 2,96 mm2 za rane, zdravljene s kontrolno skupino, vendar ta razlika ni dosegla statistične značilnosti (p = 0,488) (slika 6I). Nasprotno pa po zdravljenju s oblogami Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) ali Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) ni bilo opaženega zmanjšanja površine rane v primerjavi s kontrolno skupino. Pri uporabi obloge Ag oxysol so v primerjavi s kontrolno skupino opazili povečano regeneracijo epitelija (30 % v primerjavi z 22 %), čeprav to ni doseglo statistične značilnosti (p = 0,067), je to precej pomembno in potrjuje prejšnje rezultate. Obloga z oxysoli spodbuja ponovno epitelizacijo. - Epitelizacija neokuženih ran17. Nasprotno pa zdravljenje s oblogami Ag1+ ali Ag1+ + EDTA/BC ni imelo učinka ali pa je pokazalo zmanjšano ponovno epitelizacijo v primerjavi s kontrolno skupino.
Vpliv srebrnega povoja za rane na celjenje ran pri neokuženih miših s popolno resekcijo. (AD) Reprezentativne makroskopske slike ran po treh dneh zdravljenja z neantimikrobnim kontrolnim povojem in srebrnim povojem. (EH) Reprezentativni prerezi ran, obarvani s hematoksilinom in eozinom. Kvantifikacija površine rane (I) in odstotek reepitelizacije (J) sta bila izračunana iz histoloških prerezov na sredini rane z uporabo programske opreme za analizo slik (n = 11–12 na tretirano skupino). Grafi prikazujejo povprečje +/- standardno napako. * pomeni p = <0,05.
Srebro se že dolgo uporablja kot protimikrobno zdravilo pri celjenju ran, vendar lahko številne različne formulacije in načini dajanja povzročijo razlike v učinkovitosti protimikrobnih zdravil 18. Poleg tega lastnosti antibiofilma specifičnih sistemov za dajanje srebra niso popolnoma razumljene. Čeprav je imunski odziv gostitelja relativno učinkovit proti planktonskim bakterijam, je na splošno manj učinkovit proti biofilmom 19. Makrofagi zlahka fagocitirajo planktonske bakterije, vendar znotraj biofilmov agregirane celice predstavljajo dodatne težave, saj omejujejo odziv gostitelja do te mere, da lahko imunske celice doživijo apoptozo in sproščajo provnetne dejavnike za okrepitev imunskega odziva 20. Ugotovljeno je bilo, da lahko nekateri levkociti prodrejo skozi biofilme 21, vendar ne morejo fagocitirati bakterij, ko je ta obramba ogrožena 22. Za podporo imunskemu odzivu gostitelja proti okužbi z biofilmom rane je treba uporabiti celosten pristop. Čiščenje rane lahko fizično poruši biofilm in odstrani večino biološke obremenitve, vendar je lahko imunski odziv gostitelja neučinkovit proti preostalemu biofilmu, zlasti če je imunski odziv gostitelja ogrožen. Tako lahko protimikrobne terapije, kot so srebrni povoji, podpirajo imunski odziv gostitelja in odpravljajo okužbe z biofilmom. Sestava, koncentracija, topnost in substrat za dajanje lahko vplivajo na protimikrobno učinkovitost srebra. V zadnjih letih je napredek v tehnologiji predelave srebra te povoje naredil učinkovitejše9,23. Z napredkom tehnologije srebrnih povojev je pomembno razumeti učinkovitost teh povojev pri nadzoru okužbe rane in, kar je še pomembneje, vpliv teh močnih oblik srebra na okolje rane in celjenje.
V tej študiji smo primerjali učinkovitost dveh naprednih srebrnih oblog s konvencionalnimi srebrnimi oblogami, ki proizvajajo ione Ag1+ proti biofilmom, z uporabo različnih modelov in vitro in in vivo. Ocenili smo tudi učinek teh oblog na okolje rane in celjenje, neodvisno od okužbe. Da bi zmanjšali vpliv matrice za dajanje, so bile vse testirane srebrne obloge sestavljene iz karboksimetilceluloze.
Naša predhodna ocena teh srebrnih oblog proti kolonialnim biofilmom Pseudomonas aeruginosa in Staphylococcus aureus kaže, da sta za razliko od tradicionalnih oblog Ag1+ dva napredna srebrna obloga, Ag1+ + EDTA/BC in oksigenirane soli Ag, učinkovita pri 5. Učinkovito ubijata bakterije biofilma v nekaj dneh. Poleg tega te obloge preprečujejo ponovno nastanek biofilma ob ponavljajoči se izpostavljenosti planktonskim bakterijam. Obloga Ag1+ je vsebovala srebrov klorid, isto srebrovo spojino in osnovno matrico kot Ag1+ + EDTA/BC, in je imela omejen učinek na sposobnost preživetja bakterij znotraj biofilma v istem obdobju. Ugotovitev, da je bila obloga Ag1+ + EDTA/BC učinkovitejša proti biofilmu kot obloga Ag1+, ki je sestavljena iz iste matrike in srebrove spojine, podpira idejo, da so za povečanje učinkovitosti srebrovega klorida proti biofilmu potrebne dodatne sestavine, kot je bilo že poročano drugje15. Ti rezultati podpirajo idejo, da imata BC in EDTA dodatno vlogo pri splošni učinkovitosti oblog in da je odsotnost te komponente v oblogah Ag1+ morda prispevala k neuspehu pri dokazovanju učinkovitosti in vitro. Ugotovili smo, da so obloge s oksigeniranimi srebrnimi solmi, ki proizvajajo ione Ag2+ in Ag3+, pokazale močnejšo antibakterijsko učinkovitost kot Ag1+ in na ravneh, podobnih Ag1+ + EDTA/BC. Vendar pa zaradi visokega redoks potenciala ni jasno, kako dolgo ioni Ag3+ ostanejo aktivni in učinkoviti proti biofilmom ran, zato si zaslužijo nadaljnje raziskave. Poleg tega obstaja veliko različnih oblog, ki ustvarjajo ione Ag1+, ki v tej študiji niso bile testirane. Te obloge so sestavljene iz različnih srebrovih spojin, koncentracij in osnovnih matric, kar lahko vpliva na dovajanje ionov Ag1+ in njihovo učinkovitost proti biofilmom. Omeniti velja tudi, da obstaja veliko različnih modelov in vitro in in vivo, ki se uporabljajo za oceno učinkovitosti oblog za rane proti biofilmom. Vrsta uporabljenega modela ter vsebnost soli in beljakovin v medijih, uporabljenih v teh modelih, bodo vplivale na učinkovitost obloge. V našem in vivo modelu smo pustili, da je biofilm dozorel in vitro, nato pa smo ga prenesli na dermalno površino rane. Imunski odziv gostiteljske miši je relativno učinkovit proti planktonskim bakterijam, nanesenim na rano, s čimer se med celjenjem rane tvori biofilm. Dodajanje zrelega biofilma rani omejuje učinkovitost imunskega odziva gostitelja na nastanek biofilma, saj omogoča, da se zreli biofilm vzpostavi v rani, preden se lahko začne celjenje. Tako nam naš model omogoča, da ocenimo učinkovitost protimikrobnih oblog na zrelih biofilmih, preden se rane začnejo celiti.
Ugotovili smo tudi, da prileganje obloge vpliva na učinkovitost srebrnih oblog na in vitro vzgojenih biofilmih in prašičji koži. Tesen stik z rano velja za ključnega pomena za protimikrobno učinkovitost obloge24,25. Obloge, ki vsebujejo oksigenirane soli srebra, so bile v tesnem stiku z zrelimi biofilmi, kar je po 24 urah znatno zmanjšalo število živih bakterij v biofilmu. Nasprotno pa je pri zdravljenju s oblogami Ag1+ in Ag1+ + EDTA/BC ostalo veliko število živih bakterij. Te obloge vsebujejo šive vzdolž celotne dolžine obloge, kar ustvarja mrtve prostore, ki preprečujejo tesen stik z biofilmom. V naših študijah in vitro so ta nekontaktna območja preprečila uničenje živih bakterij v biofilmu. Življenjsko sposobnost bakterij smo ocenili šele po 24 urah zdravljenja; Sčasoma, ko obloga postane bolj nasičena, je lahko mrtvega prostora manj, kar zmanjša površino za te žive bakterije. Vendar to poudarja pomen sestave obloge, ne le vrste srebra v oblogi.
Čeprav so študije in vitro koristne za primerjavo učinkovitosti različnih srebrnih tehnologij, je pomembno tudi razumeti učinke teh oblog na biofilme in vivo, kjer gostiteljsko tkivo in imunski odzivi prispevajo k učinkovitosti oblog proti biofilmom. Učinek teh oblog na biofilme ran so opazovali z uporabo vrstične elektronske mikroskopije in EPS barvanja biofilma z uporabo znotrajceličnih in zunajceličnih barvil DNK. Ugotovili smo, da so bile po 3 dneh zdravljenja vse obloge učinkovite pri zmanjševanju proste DNK v ranah, okuženih z biofilmom, vendar je bila obloga Ag1+ manj učinkovita pri ranah, okuženih s Staphylococcus aureus. Vrstična elektronska mikroskopija je tudi pokazala, da je bilo v ranah, zdravljenih s srebrnimi oblogami, prisotnih bistveno manj bakterij, čeprav je bilo to bolj izrazito pri oblogi s oksigenirano srebrno soljo in oblogi Ag1+ + EDTA/BC v primerjavi z oblogo Ag1+. Ti podatki kažejo, da so imele testirane srebrne obloge različen vpliv na strukturo biofilma, vendar nobena od srebrnih oblog ni mogla izkoreniniti biofilma, kar podpira potrebo po celostnem pristopu k zdravljenju okužb biofilma ran; uporaba srebrnih obližev. Zdravljenju predhodi fizični debridement, s katerim se odstrani večina biofilma.
Kronične rane so pogosto v stanju hudega vnetja, pri čemer odvečne vnetne celice ostanejo v tkivu rane dlje časa, kar povzroča poškodbe tkiva in izčrpava kisik, potreben za učinkovito celično presnovo in delovanje v rani26. Biofilmi poslabšajo to sovražno okolje rane, saj negativno vplivajo na celjenje na različne načine, vključno z zaviranjem proliferacije in migracije celic ter aktivacijo provnetnih citokinov27. Ker srebrni povoji postajajo vse učinkovitejši, je pomembno razumeti njihov vpliv na okolje rane in celjenje.
Zanimivo je, da čeprav so vsi srebrni povoji vplivali na sestavo biofilma, so le povoji s oksidiranimi srebrovimi solmi povečali ponovno epitelizacijo teh okuženih ran. Ti podatki podpirajo naše prejšnje ugotovitve17 in ugotovitve Kalana in sodelavcev (2017)28, ki so pokazali dobre profile varnosti in toksičnosti oksidiranih srebrovih soli, saj so bile nižje koncentracije srebra učinkovite proti biofilmom.
Naša trenutna študija poudarja razlike v tehnologiji srebra med protimikrobnimi srebrnimi oblogami in vpliv te tehnologije na okolje rane in celjenje, neodvisno od okužbe. Vendar se ti rezultati razlikujejo od prejšnjih študij, ki so pokazale, da je obloga Ag1+ + EDTA/BC izboljšala parametre celjenja poškodovanih zajčjih ušes in vivo. Vendar je to lahko posledica razlik v živalskih modelih, časih meritev in metodah nanašanja bakterij29. V tem primeru so bile meritve rane opravljene 12 dni po poškodbi, da so aktivne sestavine obloge lahko delovale na biofilm dlje časa. To podpira študija, ki je pokazala, da so se klinično okužene razjede na nogah, zdravljene z Ag1+ + EDTA/BC, sprva povečale po enem tednu zdravljenja, nato pa v naslednjih 3 tednih zdravljenja z Ag1+ + EDTA/BC in v 4 tednih uporabe neantimikrobnih zdravil. obloge s CMC za zmanjšanje velikosti razjed30.
Določene oblike in koncentracije srebra so se že prej izkazale za citotoksične in vitro 11, vendar se ti rezultati in vitro ne odražajo vedno v neželenih učinkih in vivo. Poleg tega sta napredek v tehnologiji srebra in boljše razumevanje srebrovih spojin in koncentracij v oblogah privedla do razvoja številnih varnih in učinkovitih srebrnih oblog. Vendar pa je z napredkom tehnologije srebrnih oblog pomembno razumeti vpliv teh oblog na okolje rane 31, 32, 33. Predhodno je bilo poročano, da povečana stopnja ponovne epitelizacije ustreza povečanemu deležu protivnetnih makrofagov M2 v primerjavi s provnetnim fenotipom M1. To so opazili v prejšnjem mišjem modelu, kjer so obloge za rane iz srebrnega hidrogela primerjali s srebrnim sulfadiazinom in neantimikrobnimi hidrogeli 34.
Kronične rane lahko kažejo prekomerno vnetje in opaženo je bilo, da je prisotnost presežnih nevtrofilcev lahko škodljiva za celjenje ran35. V študiji na miših z zmanjšanim številom nevtrofilcev je prisotnost nevtrofilcev upočasnila reepitelizacijo. Prisotnost presežnih nevtrofilcev vodi do visokih ravni proteaz in reaktivnih kisikovih spojin, kot sta superoksid in vodikov peroksid, ki so povezane s kroničnimi in počasi celječimi se ranami37,38. Prav tako lahko povečanje števila makrofagov, če ni nadzorovano, povzroči zapoznelo celjenje ran39. To povečanje je še posebej pomembno, če makrofagi ne morejo preiti iz provnetnega fenotipa v proceljujoči fenotip, zaradi česar rane ne morejo zapustiti vnetne faze celjenja40. Opazili smo zmanjšanje števila nevtrofilcev in makrofagov v ranah, okuženih z biofilmom, po 3 dneh zdravljenja z vsemi srebrnimi oblogami, vendar je bilo zmanjšanje bolj izrazito pri oblogah s kisikovo soljo. To zmanjšanje je lahko neposredna posledica imunskega odziva na srebro, odziva na zmanjšano biološko obremenitev ali tega, da je rana v poznejši fazi celjenja in se zato zmanjša število imunskih celic v rani. Zmanjšanje števila vnetnih celic v rani lahko ohranja okolje, ki je ugodno za celjenje ran. Mehanizem delovanja, kako srebrne oksisoli spodbujajo celjenje, neodvisno od okužbe, ni jasen, vendar pa lahko sposobnost srebrnih oksisoli, da proizvajajo kisik in uničujejo škodljive ravni vodikovega peroksida, mediatorja vnetja, to pojasni in zahteva nadaljnje raziskave17.
Kronične, neceljive okužene rane predstavljajo problem tako za zdravnike kot za paciente. Čeprav mnogi obliži trdijo, da so protimikrobno učinkoviti, se raziskave le redko osredotočajo na druge ključne dejavnike, ki vplivajo na mikrookolje rane. Ta študija kaže, da imajo različne tehnologije srebra različno protimikrobno učinkovitost in, kar je pomembno, različne učinke na okolje rane in celjenje, neodvisno od okužbe. Čeprav te študije in vitro in in vivo kažejo na učinkovitost teh obližev pri zdravljenju okužb ran in spodbujanju celjenja, so za oceno učinkovitosti teh obližev v kliniki potrebne randomizirane kontrolirane študije.
Nabori podatkov, uporabljeni in/ali analizirani med trenutno študijo, so na voljo pri ustreznem avtorju na razumno zahtevo.
Čas objave: 15. julij 2024