Heterogenost vlaken človeških skeletnih mišic onkraj težke verige miozina

Hvala, ker ste obiskali nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo uporabo najnovejše različice brskalnika (ali onemogočanje načina združljivosti v Internet Explorerju). Poleg tega bo za zagotovitev nadaljnje podpore to spletno mesto brez slogov in JavaScripta.
Skeletne mišice so heterogeno tkivo, sestavljeno pretežno iz miofibril, ki so pri ljudeh običajno razvrščene v tri tipe: en "počasen" (tip 1) in dva "hitra" (tipa 2A in 2X). Vendar pa heterogenost med tradicionalnimi tipi miofibril in znotraj njih ostaja slabo razumljena. Uporabili smo transkriptomske in proteomske pristope na 1050 oziroma 1038 posameznih miofibril iz človeškega vastus lateralis. Proteomska študija je vključevala moške, transkriptomska študija pa 10 moških in 2 ženski. Poleg izooblik težkih verig miozina smo kot vire večdimenzionalne variabilnosti med miofibrilami identificirali presnovne beljakovine, ribosomske beljakovine in celične stične beljakovine. Poleg tega naši podatki kljub identifikaciji grozdov počasnih in hitrih vlaken kažejo, da se vlakna tipa 2X fenotipsko ne razlikujejo od drugih hitrih vlaken. Poleg tega klasifikacija na podlagi težkih verig miozina ni zadostna za opis fenotipa miofibril pri nemalinskih miopatijah. Na splošno naši podatki kažejo na večdimenzionalno heterogenost miofibril, pri čemer viri variacij segajo onkraj izooblik težke verige miozina.
Celična heterogenost je inherentna značilnost vseh bioloških sistemov, ki celicam omogoča specializacijo za zadovoljevanje različnih potreb tkiv in celic.1 Tradicionalni pogled na heterogenost vlaken skeletnih mišic je bil, da motorični nevroni določajo tip vlaken znotraj motorične enote in da tip vlaken (tj. tip 1, tip 2A in tip 2X pri ljudeh) določajo značilnosti izooblik miozinske težke verige (MYH).2 To je sprva temeljilo na njihovi nestabilnosti pH ATPaze,3,4 in kasneje na njihovi molekularni ekspresiji MYH.5 Vendar pa se z identifikacijo in poznejšim sprejetjem "mešanih" vlaken, ki sočasno izražajo več MYH v različnih razmerjih, vlakna skeletnih mišic vse bolj obravnavajo kot kontinuum in ne kot ločene tipe vlaken.6 Kljub temu se področje še vedno močno zanaša na MYH kot primarni klasifikator za klasifikacijo mišičnih vlaken, kar je verjetno posledica omejitev in pomembnih pristranskosti zgodnjih študij na glodavcih, katerih profili ekspresije MYH in razpon tipov vlaken se razlikujejo od tistih pri ljudeh.2 Situacijo še dodatno zapleta dejstvo, da različne človeške skeletne mišice kažejo raznoliko paleto tipov vlaken.7 Vastus lateralis je mešana mišica s srednjim (in zato reprezentativnim) profilom izražanja MYH.7 Poleg tega je zaradi enostavnosti vzorčenja najbolje preučena mišica pri ljudeh.
Zato je nepristransko preučevanje raznolikosti vlaken skeletnih mišic z uporabo zmogljivih orodij »omika« ključnega pomena, a tudi zahtevno, deloma zaradi večjedrne narave vlaken skeletnih mišic. Vendar pa sta transkriptomski8,9 in proteomski10 tehnologiji v zadnjih letih doživeli revolucijo v občutljivosti zaradi različnih tehnoloških dosežkov, ki omogočajo analizo skeletnih mišic z ločljivostjo posameznih vlaken. Posledično je bil dosežen pomemben napredek pri karakterizaciji raznolikosti posameznih vlaken in njihovega odziva na atrofične dražljaje in staranje11,12,13,14,15,16,17,18. Pomembno je, da imajo ti tehnološki dosežki klinične aplikacije, ki omogočajo podrobnejšo in natančnejšo karakterizacijo disregulacije, povezane z boleznijo. Na primer, patofiziologija nemalinske miopatije, ene najpogostejših dednih mišičnih bolezni (MIM 605355 in MIM 161800), je kompleksna in zmedena.19,20 Zato bi boljša karakterizacija disregulacije vlaken skeletnih mišic lahko privedla do pomembnega napredka v našem razumevanju te bolezni.
Razvili smo metode za transkriptomsko in proteomsko analizo posameznih vlaken skeletnih mišic, ročno izoliranih iz vzorcev človeške biopsije, in jih uporabili na tisočih vlaknih, kar nam je omogočilo raziskovanje celične heterogenosti vlaken človeških skeletnih mišic. V okviru tega dela smo pokazali moč transkriptomskega in proteomskega fenotipiziranja mišičnih vlaken ter identificirali presnovne, ribosomske in celične stične beljakovine kot pomembne vire variabilnosti med vlakni. Poleg tega smo s tem proteomskim potekom dela opredelili klinični pomen nematodne miopatije v posameznih vlaknih skeletnih mišic, kar je razkrilo usklajen premik k neoksidativnim vlaknom, neodvisnim od tipa vlaken na podlagi MYH.
Za raziskavo heterogenosti človeških skeletnih mišičnih vlaken smo razvili dva delovna toka, ki omogočata analizo transkriptoma in proteoma posameznih skeletnih mišičnih vlaken (slika 1A in dopolnilna slika 1A). Razvili in optimizirali smo več metodoloških korakov, od shranjevanja vzorcev in ohranjanja integritete RNK in beljakovin do optimizacije pretočnosti za vsak pristop. Za analizo transkriptoma smo to dosegli z vstavitvijo molekularnih črtnih kod, specifičnih za vzorec, v začetni korak reverzne transkripcije, kar je omogočilo združevanje 96 vlaken za učinkovito nadaljnjo obdelavo. Globlje sekvenciranje (±1 milijon odčitkov na vlakno) v primerjavi s tradicionalnimi pristopi z eno samo celico je dodatno obogatilo podatke o transkriptomu.21 Za proteomiko smo uporabili kratek kromatografski gradient (21 minut) v kombinaciji z zajemanjem podatkov DIA-PASEF na masnem spektrometru timsTOF, da bi optimizirali globino proteoma ob hkratnem ohranjanju visoke pretočnosti. 22,23 Za raziskavo heterogenosti zdravih skeletnih mišičnih vlaken smo okarakterizirali transkriptome 1050 posameznih vlaken 14 zdravih odraslih darovalcev in proteome 1038 vlaken 5 zdravih odraslih darovalcev (dodatna tabela 1). V tem članku so ti nabori podatkov označeni kot transkriptomi oziroma proteomi 1000 vlaken. Z našim pristopom smo v transkriptomskih in proteomskih analizah 1000 vlaken zaznali skupno 27.237 transkriptov in 2.983 beljakovin (slika 1A, dodatni nabori podatkov 1–2). Po filtriranju transkriptomskih in proteomskih naborov podatkov za >1000 zaznanih genov in 50 % veljavnih vrednosti na vlakno so bile izvedene nadaljnje bioinformatične analize za 925 oziroma 974 vlaken v transkriptomu oziroma proteomu. Po filtriranju je bilo na vlakno zaznanih povprečno 4257 ± 1557 genov in 2015 ± 234 beljakovin (povprečje ± SD), z omejeno interindividualno variabilnostjo (dodatne slike 1B–C, dodatni nabori podatkov 3–4). Vendar pa je bila variabilnost znotraj posameznika bolj izrazita med udeleženci, verjetno zaradi razlik v izkoristku RNA/beljakovin med vlakni različnih dolžin in prečnih prerezov. Za večino beljakovin (> 2000) je bil koeficient variacije pod 20 % (dodatna slika 1D). Obe metodi sta omogočili zajem širokega dinamičnega razpona transkriptov in beljakovin z visoko izraženimi podpisi, pomembnimi za krčenje mišic (npr. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (dodatne slike 1E–F). Večina identificiranih značilnosti je bila skupna med transkriptomskimi in proteomskimi nabori podatkov (dodatna slika 1G), povprečne intenzivnosti UMI/LFQ teh značilnosti pa so bile razmeroma dobro korelirane (r = 0,52) (dodatna slika 1H).
Delovni tok za transkriptomiko in proteomiko (ustvarjeno z BioRender.com). BD Krivulje dinamičnega razpona za MYH7, MYH2 in MYH1 ter izračunani pragovi za dodelitev tipa vlaken. E, F Porazdelitev izražanja MYH po vlaknih v transkriptomskih in proteomskih naborih podatkov. G, H Diagrami aproksimacije in projekcije enakomerne raznolikosti (UMAP) za transkriptomiko in proteomiko, obarvani glede na tip vlaken na osnovi MYH. I, J Diagrami značilnosti, ki prikazujejo izražanje MYH7, MYH2 in MYH1 v transkriptomskih in proteomskih naborih podatkov.
Sprva smo si zadali cilj, da vsakemu vlaknu dodelimo tip vlaken na osnovi MYH z uporabo optimiziranega pristopa, ki izkorišča visoko občutljivost in dinamični razpon izražanja MYH v omics naborih podatkov. Prejšnje študije so uporabljale poljubne pragove za označevanje vlaken kot čistih tipov 1, 2A, 2X ali mešanih na podlagi fiksnega odstotka izražanja različnih MYH11,14,24. Uporabili smo drugačen pristop, pri katerem smo izražanje vsakega vlakna razvrstili glede na MYH, ki smo jih uporabili za tipizacijo vlaken: MYH7, MYH2 in MYH1, ki ustrezajo vlaknom tipa 1, tipa 2A oziroma tipa 2X. Nato smo matematično izračunali spodnjo prevojno točko vsake nastale krivulje in jo uporabili kot prag za dodelitev vlaken kot pozitivnih (nad pragom) ali negativnih (pod pragom) za vsak MYH (slika 1B–D). Ti podatki kažejo, da imata MYH7 (slika 1B) in MYH2 (slika 1C) bolj izrazite profile izražanja vklop/izklop na ravni RNA v primerjavi z ravnijo beljakovin. Dejansko na ravni beljakovin zelo malo vlaken ni izražalo MYH7 in nobeno vlakno ni imelo 100-odstotne ekspresije MYH2. Nato smo uporabili vnaprej določene pragove ekspresije, da smo vsem vlaknom v vsakem naboru podatkov dodelili tipe vlaken na osnovi MYH. Na primer, vlakna MYH7+/MYH2-/MYH1- so bila dodeljena tipu 1, medtem ko so bila vlakna MYH7-/MYH2+/MYH1+ dodeljena mešanemu tipu 2A/2X (za popoln opis glejte dodatno tabelo 2). Z združevanjem vseh vlaken smo opazili izjemno podobno porazdelitev tipov vlaken na osnovi MYH tako na ravni RNA (slika 1E) kot na ravni beljakovin (slika 1F), medtem ko se je relativna sestava tipov vlaken na osnovi MYH med posamezniki razlikovala, kot je bilo pričakovano (dodatna slika 2A). Večina vlaken je bila razvrščenih bodisi kot čisti tip 1 (34–35 %) bodisi kot tip 2A (36–38 %), čeprav je bilo zaznanih tudi veliko število mešanih vlaken tipa 2A/2X (16–19 %). Presenetljiva razlika je v tem, da je bilo mogoče čista vlakna tipa 2X zaznati le na ravni RNA, ne pa tudi na ravni beljakovin, kar kaže na to, da je hitra ekspresija MYH vsaj delno regulirana po transkripciji.
Našo metodo tipizacije vlaken MYH, ki temelji na proteomiki, smo validirali z uporabo dot blottinga na osnovi protiteles in obe metodi sta dosegli 100-odstotno ujemanje pri identifikaciji čistih vlaken tipa 1 in tipa 2A (glej dodatno sliko 2B). Vendar pa je bil pristop, ki temelji na proteomiki, občutljivejši, učinkovitejši pri identifikaciji mešanih vlaken in kvantificiranju deleža vsakega gena MYH v vsakem vlaknu. Ti podatki dokazujejo učinkovitost uporabe objektivnega, zelo občutljivega pristopa, ki temelji na omiki, za karakterizacijo tipov vlaken skeletnih mišic.
Nato smo uporabili kombinirane informacije, ki jih zagotavljata transkriptomika in proteomika, za objektivno razvrstitev mišičnih vlaken na podlagi njihovega celotnega transkriptoma ali proteoma. Z metodo aproksimacije in projekcije enakomernih mnogoterosti (UMAP) za zmanjšanje dimenzionalnosti na šest glavnih komponent (dodatne slike 3A–B) smo lahko vizualizirali variabilnost mišičnih vlaken v transkriptomu (slika 1G) in proteomu (slika 1H). Omeniti velja, da mišična vlakna niso bila razvrščena po udeležencih (dodatne slike 3C–D) ali dnevih testiranja (dodatna slika 3E) niti v transkriptomskih niti v proteomskih naborih podatkov, kar kaže na to, da je variabilnost znotraj subjekta v skeletnih mišičnih vlaknih večja kot variabilnost med subjekti. Na diagramu UMAP sta se pojavila dva različna grozda, ki predstavljata »hitra« in »počasna« mišična vlakna (sliki 1G–H). Miofibrila MYH7+ (počasna) so bila združena na pozitivnem polu UMAP1, medtem ko so bila miofibrila MYH2+ in MYH1+ (hitra) združena na negativnem polu UMAP1 (sliki 1I–J). Vendar pa ni bilo razlikovanja med tipi hitrih vlaken (tj. tip 2A, tip 2X ali mešana 2A/2X) na podlagi izražanja MYH, kar kaže na to, da izražanje MYH1 (slika 1I–J) ali drugih klasičnih označevalcev miofibril 2X, kot sta ACTN3 ali MYLK2 (dodatne slike 4A–B), ne razlikuje med različnimi tipi miofibril, če upoštevamo celoten transkriptom ali proteom. Poleg tega je bilo v primerjavi z MYH2 in MYH7 le malo transkriptov ali beljakovin pozitivno koreliranih z MYH1 (dodatne slike 4C–H), kar kaže na to, da številčnost MYH1 ne odraža v celoti transkriptoma/proteoma miofibril. Podobni zaključki so bili doseženi pri ocenjevanju mešane ekspresije treh izooblik MYH na ravni UMAP (dodatne slike 4I–J). Medtem ko je torej mogoče vlakna 2X identificirati na ravni transkripta samo na podlagi kvantifikacije MYH, se vlakna MYH1+ ne razlikujejo od drugih hitrih vlaken, če upoštevamo celoten transkriptom ali proteom.
Kot začetno raziskovanje heterogenosti počasnih vlaken onkraj MYH smo ocenili štiri uveljavljene proteine, specifične za tip počasnih vlaken: TPM3, TNNT1, MYL3 in ATP2A22. Podtipi počasnih vlaken so pokazali visoke, čeprav ne popolne, Pearsonove korelacije z MYH7 tako v transkriptomiki (dodatna slika 5A) kot v proteomiki (dodatna slika 5B). Približno 25 % oziroma 33 % počasnih vlaken ni bilo razvrščenih kot čista počasna vlakna po vseh podtipih genov/proteinov v transkriptomiki (dodatna slika 5C) oziroma proteomiki (dodatna slika 5D). Zato klasifikacija počasnih vlaken na podlagi več podtipov genov/proteinov uvaja dodatno kompleksnost, tudi za proteine, za katere je znano, da so specifični za tip vlaken. To kaže, da klasifikacija vlaken na podlagi izooblik ene same družine genov/proteinov morda ne odraža ustrezno resnične heterogenosti vlaken skeletnih mišic.
Za nadaljnje raziskovanje fenotipske variabilnosti vlaken človeških skeletnih mišic na ravni celotnega omics modela smo izvedli nepristransko redukcijo dimenzionalnosti podatkov z uporabo analize glavnih komponent (PCA) (slika 2A). Podobno kot pri grafih UMAP niti udeleženec niti dan testiranja nista vplivala na združevanje vlaken na ravni PCA (dodatne slike 6A–C). V obeh naborih podatkov je bil tip vlaken na osnovi MYH pojasnjen s PC2, ki je pokazal skupek počasnih vlaken tipa 1 in drugi skupek, ki je vseboval hitro trzajoča vlakna tipa 2A, tipa 2X in mešana vlakna 2A/2X (slika 2A). V obeh naborih podatkov sta bila ta dva skupka povezana z majhnim številom mešanih vlaken tipa 1/2A. Kot je bilo pričakovano, je analiza prekomerne zastopanosti glavnih gonilnikov PC potrdila, da PC2 poganjajo kontraktilni in presnovni podpisi (slika 2B in dodatne slike 6D–E, dodatni nabori podatkov 5–6). Na splošno se je izkazalo, da je tip vlaken na osnovi MYH zadosten za razlago neprekinjenih variacij vzdolž PC2, z izjemo tako imenovanih 2X vlaken, ki so bila porazdeljena po celotnem transkriptomu znotraj hitrega grozda.
A. Diagrami analize glavnih komponent (PCA) transkriptomskih in proteomskih naborov podatkov, obarvani glede na vrsto vlaken na podlagi MYH. B. Analiza obogatitve transkriptnih in proteinskih gonilnikov v PC2 in PC1. Statistična analiza je bila izvedena z uporabo paketa clusterProfiler in p-vrednosti, prilagojenih Benjamini-Hochbergu. C, D. PCA diagrami, obarvani glede na izraze ontologije genov medcelične adhezije (GO) v transkriptomu in izraze GO kostamer v proteomu. Puščice predstavljajo transkriptne in proteinske gonilnike ter njihove smeri. E, F. Diagrami klinično pomembnih značilnosti z aproksimacijo in projekcijo enakomerne mnogoterosti (UMAP), ki prikazujejo gradiente izražanja neodvisno od vrste počasnih/hitrih vlaken. G, H. Korelacije med gonilniki PC2 in PC1 v transkriptomih in proteomih.
Nepričakovano je tip miofibril na osnovi MYH pojasnil le drugo najvišjo stopnjo variabilnosti (PC2), kar kaže na to, da imajo drugi biološki dejavniki, ki niso povezani s tipom miofibril na osnovi MYH (PC1), pomembno vlogo pri uravnavanju heterogenosti vlaken skeletnih mišic. Analiza prekomerne zastopanosti glavnih gonilnih sil v PC1 je pokazala, da je bila variabilnost v PC1 primarno določena z adhezijo celic in vsebnostjo ribosomov v transkriptomu ter kostamerami in ribosomskimi beljakovinami v proteomu (slika 2B in dodatne slike 6D–E, dodatni nabor podatkov 7). V skeletnih mišicah kostameri povezujejo Z-disk s sarkolemo in sodelujejo pri prenosu sile in signalizaciji. 25 Označeni PCA grafi z uporabo značilnosti adhezije celic (transkriptom, slika 2C) in kostamera (proteom, slika 2D) so pokazali močan premik v levo v PC1, kar kaže, da so te značilnosti obogatene z določenimi vlakni.
Podrobnejši pregled združevanja mišičnih vlaken na ravni UMAP je pokazal, da večina značilnosti kaže od tipa vlaken neodvisen gradient izražanja na osnovi MYH in ne specifičen za podskupine mišičnih vlaken. Ta kontinuiteta je bila opažena pri več genih, povezanih s patološkimi stanji (slika 2E), kot so CHCHD10 (živčno-mišična bolezen), SLIT3 (mišična atrofija) in CTDNEP1 (mišična bolezen). Ta kontinuiteta je bila opažena tudi v celotnem proteomu, vključno z beljakovinami, povezanimi z nevrološkimi motnjami (UGDH), inzulinsko signalizacijo (PHIP) in transkripcijo (HIST1H2AB) (slika 2F). Ti podatki skupaj kažejo na kontinuiteto v heterogenosti počasnega/hitrega trzanja, neodvisni od tipa vlaken, v različnih mišičnih vlaknih.
Zanimivo je, da so gonilni geni v PC2 pokazali dobro korelacijo med transkriptomom in proteomom (r = 0,663) (slika 2G), kar kaže na to, da so tipi vlaken s počasnim in hitrim trzanjem, zlasti kontraktilne in presnovne lastnosti vlaken skeletnih mišic, transkripcijsko regulirani. Vendar pa gonilni geni v PC1 niso pokazali korelacije med transkriptomom in proteomom (r = -0,027) (slika 2H), kar kaže na to, da so variacije, ki niso povezane s tipi vlaken s počasnim/hitrim trzanjem, v veliki meri regulirane posttranskripcijsko. Ker so bile variacije v PC1 pojasnjene predvsem z ontološkimi izrazi ribosomskih genov in ker ribosomi igrajo ključno in specializirano vlogo v celici, saj aktivno sodelujejo pri prevajanju beljakovin in nanj vplivajo,31 smo se nato lotili raziskave te nepričakovane heterogenosti ribosomov.
Najprej smo pobarvali diagram analize glavnih komponent proteomike glede na relativno številčnost beljakovin v izrazu GOCC "citoplazemski ribosom" (slika 3A). Čeprav je ta izraz obogaten na pozitivni strani PC1, kar ima za posledico majhen gradient, ribosomske beljakovine poganjajo porazdelitev v obe smeri PC1 (slika 3A). Ribosomske beljakovine, obogatene na negativni strani PC1, so vključevale RPL18, RPS18 in RPS13 (slika 3B), medtem ko so bili RPL31, RPL35 in RPL38 (slika 3C) glavni dejavniki na pozitivni strani PC1. Zanimivo je, da sta bila RPL38 in RPS13 močno izražena v skeletnih mišicah v primerjavi z drugimi tkivi (dodatna slika 7A). Teh značilnih ribosomskih podpisov v PC1 nismo opazili v transkriptomu (dodatna slika 7B), kar kaže na posttranskripcijsko regulacijo.
A. Diagram analize glavnih komponent (PCA), obarvan glede na izraze citoplazemske ribosomske genske ontologije (GO) po proteomu. Puščice označujejo smer beljakovinsko posredovanih variacij na diagramu PCA. Dolžina črte ustreza rezultatu glavnih komponent za dani protein. B, C. Diagrami značilnosti PCA za RPS13 in RPL38. D. Nenadzorovana hierarhična analiza združevanja citoplazemskih ribosomskih proteinov. E. Strukturni model ribosoma 80S (PDB: 4V6X), ki poudarja ribosomske proteine ​​z različno abundanco v vlaknih skeletnih mišic. F. Ribosomski proteini z različno stehiometrijo, lokalizirani v bližini izhodnega kanala mRNA.
Koncepta ribosomske heterogenosti in specializacije sta bila predlagana že prej, pri čemer lahko prisotnost različnih subpopulacij ribosomov (ribosomska heterogenost) neposredno vpliva na prevajanje beljakovin v različnih tkivih32 in celicah33 s selektivnim prevajanjem specifičnih skupin transkriptov mRNA34 (specializacija ribosomov). Za identifikacijo subpopulacij ribosomskih beljakovin, ki se sočasno izražajo v vlaknih skeletnih mišic, smo izvedli nenadzorovano hierarhično analizo združevanja ribosomskih beljakovin v proteomu (slika 3D, dodatni nabor podatkov 8). Kot je bilo pričakovano, se ribosomske beljakovine niso združevale po tipu vlaken na podlagi MYH. Vendar smo identificirali tri različne skupine ribosomskih beljakovin; prva skupina (ribosomska_skupina_1) je soregulirana z RPL38 in ima zato povečano izražanje v vlaknih s pozitivnim profilom PC1. Druga skupina (ribosomska_skupina_2) je soregulirana z RPS13 in je povišana v vlaknih z negativnim profilom PC1. Tretja skupina (ribosomska_skupina_3) ne kaže koordinirane diferencialne ekspresije v vlaknih skeletnih mišic in jo lahko štejemo za "jedrni" ribosomski protein skeletnih mišic. Oba ribosomska grozda 1 in 2 vsebujeta ribosomske beljakovine, za katere je bilo že prej dokazano, da uravnavajo alternativno prevajanje (npr. RPL10A, RPL38, RPS19 in RPS25) in funkcionalno vplivajo na razvoj (npr. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 V skladu z rezultati PCA je opažena heterogena zastopanost teh ribosomskih beljakovin po vlaknih prav tako pokazala kontinuiteto (dodatna slika 7C).
Za vizualizacijo lokacije heterogenih ribosomskih proteinov znotraj ribosoma smo uporabili strukturni model človeškega ribosoma 80S (Protein Data Bank: 4V6X) (slika 3E). Po izolaciji ribosomskih proteinov, ki pripadajo različnim ribosomskim skupinam, njihove lokacije niso bile tesno poravnane, kar kaže na to, da naš pristop ni zagotovil obogatitve za določene regije/frakcije ribosoma. Zanimivo pa je, da je bil delež proteinov velikih podenot v skupini 2 nižji kot v skupinah 1 in 3 (dodatna slika 7D). Opazili smo, da so bili proteini s spremenjeno stehiometrijo v vlaknih skeletnih mišic pretežno lokalizirani na površini ribosoma (slika 3E), kar je skladno z njihovo sposobnostjo interakcije z elementi notranjega mesta vstopa ribosoma (IRES) v različnih populacijah mRNA, s čimer usklajujejo selektivno translacijo. 40, 41 Poleg tega so bili številni proteini s spremenjeno stehiometrijo v vlaknih skeletnih mišic nameščeni v bližini funkcionalnih regij, kot je izhodni tunel mRNA (slika 3F), ki selektivno uravnavajo translacijsko podaljševanje in zaustavitev specifičnih peptidov. 42 Če povzamemo, naši podatki kažejo, da stehiometrija ribosomskih proteinov skeletnih mišic kaže heterogenost, kar povzroča razlike med vlakni skeletnih mišic.
Nato smo se lotili identifikacije podpisov hitrih in počasnih vlaken ter raziskovanja mehanizmov njihove transkripcijske regulacije. S primerjavo grozdov hitrih in počasnih vlaken, ki jih definira UMAP v obeh naborih podatkov (sliki 1G–H in 4A–B), smo s transkriptomskimi in proteomskimi analizami identificirali 1366 oziroma 804 različno številčnih značilnosti (sliki 4A–B, dodatni nabori podatkov 9–12). Opazili smo pričakovane razlike v podpisih, povezanih s sarkomerami (npr. tropomiozin in troponin), sklopitvijo vzbujanja in krčenja (izooblike SERCA) in presnovo energije (npr. ALDOA in CKB). Poleg tega so bili transkripti in beljakovine, ki uravnavajo ubikvitinacijo beljakovin, različno izraženi v hitrih in počasnih vlaknih (npr. USP54, SH3RF2, USP28 in USP48) (sliki 4A–B). Poleg tega je bil gen mikrobne beljakovine RP11-451G4.2 (DWORF), za katerega je bilo predhodno dokazano, da se različno izraža v različnih tipih mišičnih vlaken jagnjet43 in povečuje aktivnost SERCA v srčni mišici44, znatno povečan v počasnih skeletnih mišičnih vlaknih (slika 4A). Podobno so bile na ravni posameznih vlaken opažene pomembne razlike v znanih podpisih, kot so izooblike laktat dehidrogenaze, povezane z metabolizmom (LDHA in LDHB, slika 4C in dopolnilna slika 8A)45,46, kot tudi prej neznani podpisi, specifični za tip vlaken (kot so IRX3, USP54, USP28 in DPYSL3) (slika 4C). Med transkriptomskimi in proteomskimi nabori podatkov je prišlo do znatnega prekrivanja različno izraženih značilnosti (dodatna slika 8B), pa tudi do korelacije kratnosti spremembe, ki jo je v glavnem poganjalo izrazitejše različno izražanje značilnosti sarkomer (dodatna slika 8C). Omeniti velja, da so nekateri podpisi (npr. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) pokazali močno posttranskripcijsko regulacijo le na proteomski ravni in so imeli profile ekspresije, specifične za tip vlaken s počasnim/hitrim trzanjem (dodatna slika 8C).
A in B vulkanska diagrama, ki primerjata počasne in hitre grozde, identificirane z diagrami enakomerne mnogoterosti in projekcije (UMAP) na slikah 1G–H. Barvne pike predstavljajo transkripte ali beljakovine, ki se bistveno razlikujejo pri FDR < 0,05, temnejše pike pa predstavljajo transkripte ali beljakovine, ki se bistveno razlikujejo pri logaritemski spremembi > 1. Dvosmerna statistična analiza je bila izvedena z uporabo Waldovega testa DESeq2 z Benjamini-Hochbergovo prilagojenimi p-vrednostmi (transkriptomika) ali metodo linearnega modela Limma z empirično Bayesovo analizo, ki ji je sledila Benjamini-Hochbergova prilagoditev za večkratne primerjave (proteomika). C Podpisni diagrami izbranih diferencialno izraženih genov ali beljakovin med počasnimi in hitrimi vlakni. D Analiza obogatitve bistveno diferencialno izraženih transkriptov in beljakovin. Prekrivajoče se vrednosti so obogatene v obeh naborih podatkov, vrednosti transkriptoma so obogatene le v transkriptomu, vrednosti proteoma pa so obogatene le v proteomu. Statistična analiza je bila izvedena z uporabo paketa clusterProfiler z Benjamini-Hochbergovo prilagojenimi p-vrednostmi. E. Transkripcijski faktorji, specifični za tip vlaken, ki jih je identificiral SCENIC na podlagi rezultatov specifičnosti regulatorjev, pridobljenih s SCENIC, in diferencialne ekspresije mRNA med tipi vlaken. F. Profiliranje izbranih transkripcijskih faktorjev, ki se diferencialno izražajo med počasnimi in hitrimi vlakni.
Nato smo izvedli analizo prekomerne zastopanosti diferencialno zastopanih genov in beljakovin (slika 4D, dodatni nabor podatkov 13). Obogatitev poti za značilnosti, ki so se razlikovale med obema naboroma podatkov, je pokazala pričakovane razlike, kot so procesi β-oksidacije maščobnih kislin in presnove ketonov (počasna vlakna), krčenje miofilamentov/mišic (hitra oziroma počasna vlakna) in katabolični procesi ogljikovih hidratov (hitra vlakna). Aktivnost serin/treonin protein fosfataze je bila prav tako povišana v hitrih vlaknih, kar so bile posledica značilnosti, kot so regulatorne in katalitske podenote fosfataze (PPP3CB, PPP1R3D in PPP1R3A), za katere je znano, da uravnavajo presnovo glikogena (47) (dodatne slike 8D–E). Druge poti, obogatene s hitrimi vlakni, so vključevale procesna (P-) telesca (YTHDF3, TRIM21, LSM2) v proteomu (dodatna slika 8F), ki so potencialno vključena v posttranskripcijsko regulacijo (48), in aktivnost transkripcijskih faktorjev (SREBF1, RXRG, RORA) v transkriptomu (dodatna slika 8G). Počasna vlakna so bila obogatena z aktivnostjo oksidoreduktaze (BDH1, DCXR, TXN2) (dodatna slika 8H), vezavo amida (CPTP, PFDN2, CRYAB) (dodatna slika 8I), zunajceličnim matriksom (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (dodatna slika 8J) in aktivnostjo receptor-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (dodatna slika 8K).
Da bi dobili nadaljnji vpogled v transkripcijsko regulacijo, ki je podlaga za značilnosti tipov počasnih/hitrih mišičnih vlaken, smo izvedli analizo obogatitve transkripcijskih faktorjev z uporabo programa SCENIC49 (dodatni nabor podatkov 14). Številni transkripcijski faktorji so bili znatno obogateni med hitrimi in počasnimi mišičnimi vlakni (slika 4E). To je vključevalo transkripcijske faktorje, kot je MAFA, ki je bil prej povezan z razvojem hitrih mišičnih vlaken,50 pa tudi več transkripcijskih faktorjev, ki prej niso bili povezani s specifičnimi genskimi programi za tip mišičnih vlaken. Med njimi so bili PITX1, EGR1 in MYF6 najbolj obogateni transkripcijski faktorji v hitrih mišičnih vlaknih (slika 4E). Nasprotno pa sta bila ZSCAN30 in EPAS1 (znan tudi kot HIF2A) najbolj obogatena transkripcijska faktorja v počasnih mišičnih vlaknih (slika 4E). V skladu s tem se je MAFA izražal v višjih ravneh v regiji UMAP, ki ustreza hitrim mišičnim vlaknom, medtem ko je imel EPAS1 nasproten vzorec izražanja (slika 4F).
Poleg znanih genov, ki kodirajo beljakovine, obstajajo številni biotipi nekodirajočih RNA, ki so lahko vključeni v regulacijo človeškega razvoja in bolezni. 51, 52 V transkriptomskih naborih podatkov več nekodirajočih RNA kaže specifičnost za tip vlaken (slika 5A in dodatni nabor podatkov 15), vključno z LINC01405, ki je zelo specifična za počasna vlakna in naj bi bila zmanjšana v mišicah bolnikov z mitohondrijsko miopatijo. 53 Nasprotno pa RP11-255P5.3, ki ustreza genu lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, kaže specifičnost za tip hitrih vlaken. Tako LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) kot RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) kažeta specifičnost za skeletne mišice (dodatne slike 9A–B) in nimata znanih kontraktilnih genov v svoji 1 Mb genomski soseščini, kar kaže na to, da imata specializirano vlogo pri uravnavanju tipov vlaken in ne pri uravnavanju sosednjih kontraktilnih genov. Profili izražanja specifičnih za tipe počasnih/hitrih vlaken pri LINC01405 oziroma RP11-255P5.3 so bili potrjeni z uporabo RNAscope (sliki 5B–C).
A. Nekodirajoči RNA transkripti so pomembno regulirani v počasnih in hitrih mišičnih vlaknih. B. Reprezentativne slike RNAscope, ki prikazujejo specifičnost tipa počasnih in hitrih vlaken LINC01405 oziroma RP11-255P5.3. Merilo = 50 μm. C. Kvantifikacija izražanja nekodirajoče RNA, specifične za tip mišičnih vlaken, kot jo je določil RNAscope (n = 3 biopsije neodvisnih posameznikov, primerjava hitrih in počasnih mišičnih vlaken znotraj vsakega posameznika). Statistična analiza je bila izvedena z dvostranskim Studentovim t-testom. Škatlasti diagrami prikazujejo mediano ter prvi in ​​tretji kvartil, pri čemer brki kažejo na najmanjše in največje vrednosti. D. Delovni tok identifikacije mikrobnih beljakovin de novo (ustvarjeno z BioRender.com). E. Mikrobna beljakovina LINC01405_ORF408:17441:17358 je specifično izražena v počasnih skeletnih mišičnih vlaknih (n = 5 biopsij neodvisnih udeležencev, primerjava hitrih in počasnih mišičnih vlaken pri vsakem udeležencu). Statistična analiza je bila izvedena z uporabo Limmove linearne modelne metode v kombinaciji z empiričnim Bayesovim pristopom, ki mu je sledila Benjamini-Hochbergova metoda za večkratne primerjave s prilagoditvijo p-vrednosti. Škatlasti diagrami prikazujejo mediano, prvi in ​​tretji kvartil, pri čemer brki kažejo na največje/najmanjše vrednosti.
Nedavne študije so pokazale, da številni domnevni nekodirajoči transkripti kodirajo prepisane mikrobne beljakovine, od katerih nekatere uravnavajo delovanje mišic.44, 55 Za identifikacijo mikrobnih beljakovin s potencialno specifičnostjo za tip vlaken smo preiskali naš nabor podatkov o 1000 vlakenskih proteomih z uporabo datoteke FASTA po meri, ki vsebuje zaporedja nekodirajočih transkriptov (n = 305), najdenih v naboru podatkov o 1000 vlakenskih transkriptomih (slika 5D). Identificirali smo 197 mikrobnih beljakovin iz 22 različnih transkriptov, od katerih jih je bilo 71 različno reguliranih med počasnimi in hitrimi skeletno-mišičnimi vlakni (dodatna slika 9C in dodatni nabor podatkov 16). Za LINC01405 so bili identificirani trije mikrobni beljakovinski produkti, od katerih je eden pokazal podobno specifičnost za počasna vlakna kot njegov transkript (slika 5E in dodatna slika 9D). Tako smo LINC01405 identificirali kot gen, ki kodira mikrobno beljakovino, specifično za počasna skeletno-mišična vlakna.
Razvili smo celovit potek dela za obsežno proteomsko karakterizacijo posameznih mišičnih vlaken in identificirali regulatorje heterogenosti vlaken v zdravih stanjih. Ta potek dela smo uporabili, da bi razumeli, kako nemalinske miopatije vplivajo na heterogenost vlaken skeletnih mišic. Nemalinske miopatije so dedne mišične bolezni, ki povzročajo mišično oslabelost in se pri prizadetih otrocih kažejo z vrsto zapletov, vključno z dihalno stisko, skoliozo in omejeno gibljivostjo okončin. 19,20 Običajno pri nemalinskih miopatijah patogene variante v genih, kot je aktin alfa 1 (ACTA1), povzročijo prevlado sestave počasnih miofibril, čeprav je ta učinek heterogen. Pomembna izjema je troponin T1 nemalinska miopatija (TNNT1), pri kateri prevladujejo hitra vlakna. Tako bi lahko boljše razumevanje heterogenosti, ki je podlaga za disregulacijo vlaken skeletnih mišic, opaženo pri nemalinskih miopatijah, pomagalo razvozlati kompleksen odnos med temi boleznimi in tipom miofibril.
V primerjavi z zdravimi kontrolnimi osebami (n=3 na skupino) so mišična vlakna, izolirana od bolnikov z nemalinsko miopatijo z mutacijami v genih ACTA1 in TNNT1, pokazala izrazito atrofijo ali distrofijo mišičnih vlaken (slika 6A, dodatna tabela 3). To je predstavljalo znatne tehnične izzive za proteomsko analizo zaradi omejene količine razpoložljivega materiala. Kljub temu smo v 272 skeletnih mišičnih vlaknih lahko zaznali 2485 beljakovin. Po filtriranju vsaj 1000 kvantificiranih beljakovin na vlakno je bilo 250 vlaken podvrženih nadaljnji bioinformatični analizi. Po filtriranju je bilo kvantificirano povprečno 1573 ± 359 beljakovin na vlakno (dodatna slika 10A, dodatni nabori podatkov 17–18). Omeniti velja, da se je kljub znatnemu zmanjšanju velikosti vlaken globina proteoma vzorcev bolnikov z nemalinsko miopatijo le nekoliko zmanjšala. Poleg tega nam je obdelava teh podatkov z uporabo lastnih datotek FASTA (vključno z nekodirajočimi transkripti) omogočila identifikacijo petih mikrobnih beljakovin v skeletnih miofibrih bolnikov z nemalinsko miopatijo (dodatni nabor podatkov 19). Dinamični razpon proteoma je bil bistveno širši, skupne beljakovine v kontrolni skupini pa so se dobro ujemale z rezultati prejšnje analize proteoma s 1000 vlakni (dodatna slika 10B–C).
A. Mikroskopske slike, ki prikazujejo atrofijo ali distrofijo vlaken in prevlado različnih tipov vlaken na podlagi MYH pri nemalinskih miopatijah ACTA1 in TNNT1 (NM). Merilo = 100 μm. Za zagotovitev ponovljivosti barvanja pri bolnikih z ACTA1 in TNNT1 so bili trije biopsije bolnikov obarvani dva do trikrat (štirje rezi na primer), preden so bile izbrane reprezentativne slike. B. Razmerja tipov vlaken pri udeležencih na podlagi MYH. C. Diagram glavne komponente (PCA) skeletnih mišičnih vlaken pri bolnikih z nemalinskimi miopatijami in kontrolni skupini. D. Skeletna mišična vlakna bolnikov z nemalinskimi miopatijami in kontrolni skupini, projicirana na diagram PCA, določen iz 1000 analiziranih vlaken na sliki 2. Na primer, vulkanski diagrami, ki primerjajo razlike med udeleženci z nemalinskimi miopatijami ACTA1 in TNNT1 in kontrolno skupino ter med udeleženci z nemalinskimi miopatijami ACTA1 in TNNT1. Barvni krogi označujejo beljakovine, ki so se statistično značilno razlikovale pri π < 0,05, temne pike pa označujejo beljakovine, ki so se statistično značilno razlikovale pri FDR < 0,05. Statistična analiza je bila izvedena z uporabo metode linearnega modela Limma in empiričnih Bayesovih metod, sledila pa je prilagoditev p-vrednosti za večkratne primerjave z uporabo metode Benjamini-Hochberg. H. Analiza obogatitve statistično značilno diferencialno izraženih beljakovin v celotnem proteomu in v vlaknih tipa 1 in 2A. Statistična analiza je bila izvedena z uporabo paketa clusterProfiler in z Benjamini-Hochbergom prilagojenih p-vrednosti. I, J. Diagrami analize glavnih komponent (PCA), obarvani z izrazi zunajceličnega matriksa in mitohondrijske genske ontologije (GO).
Ker lahko nemalinske miopatije vplivajo na delež tipov miofibril, ki izražajo MYH, v skeletnih mišicah,19,20 smo najprej preučili tipe miofibril, ki izražajo MYH, pri bolnikih z nemalinskimi miopatijami in kontrolni skupini. Tip miofibril smo določili z nepristransko metodo, ki je bila predhodno opisana za test 1000 miofibril (dodatne slike 10D–E), in spet nismo uspeli identificirati čistih 2X miofibril (slika 6B). Opazili smo heterogeni učinek nemalinskih miopatij na tip miofibril, saj sta imela dva bolnika z mutacijami ACTA1 povečan delež miofibril tipa 1, medtem ko sta imela dva bolnika z nemalinsko miopatijo TNNT1 zmanjšan delež miofibril tipa 1 (slika 6B). Dejansko je bila ekspresija MYH2 in izooblik hitrih troponin (TNNC2, TNNI2 in TNNT3) zmanjšana pri miopatijah ACTA1-nemalin, medtem ko je bila ekspresija MYH7 zmanjšana pri miopatijah TNNT1-nemalin (dodatna slika 11A). To je skladno s prejšnjimi poročili o heterogenem preklapljanju tipov miofibril pri miopatijah nemalin.19,20 Te rezultate smo potrdili z imunohistokemijo in ugotovili, da so imeli bolniki z miopatijo ACTA1-nemalin prevlado miofibril tipa 1, medtem ko so imeli bolniki z miopatijo TNNT1-nemalin nasproten vzorec (slika 6A).
Na ravni proteoma posameznih vlaken so se skeletna mišična vlakna bolnikov z nemalinsko miopatijo ACTA1 in TNNT1 združila z večino kontrolnih vlaken, pri čemer so bila vlakna z nemalinsko miopatijo TNNT1 na splošno najbolj prizadeta (slika 6C). To je bilo še posebej očitno pri risanju grafov psevdonapihnjenih vlaken z analizo glavnih komponent (PCA) za vsakega bolnika, pri čemer sta se bolnika z nemalinsko miopatijo TNNT1 2 in 3 zdela najbolj oddaljena od kontrolnih vzorcev (dodatna slika 11B, dodatni nabor podatkov 20). Da bi bolje razumeli, kako se vlakna bolnikov z miopatijo primerjajo z zdravimi vlakni, smo uporabili podrobne informacije, pridobljene s proteomsko analizo 1000 vlaken zdravih odraslih udeležencev. Vlakna iz nabora podatkov o miopatiji (bolniki z nemalinsko miopatijo ACTA1 in TNNT1 in kontrolna skupina) smo projicirali na graf PCA, pridobljen s proteomsko analizo 1000 vlaken (slika 6D). Porazdelitev tipov vlaken MYH vzdolž PC2 v kontrolnih vlaknih je bila podobna porazdelitvi vlaken, pridobljeni s proteomsko analizo 1000 vlaken. Vendar pa se je večina vlaken pri bolnikih z nemalinsko miopatijo premaknila navzdol po PC2 in se prekrivala z zdravimi hitro trzajočimi vlakni, ne glede na njihov naravni tip vlaken MYH. Čeprav so torej bolniki z nemalinsko miopatijo ACTA1 pokazali premik proti vlaknom tipa 1, ko so jih kvantificirali z metodami, ki temeljijo na MYH, sta tako ACTA1 nemalinska miopatija kot TNNT1 nemalinska miopatija proteom skeletnih mišičnih vlaken premaknili proti hitro trzajočim vlaknom.
Nato smo vsako skupino bolnikov neposredno primerjali z zdravimi kontrolnimi osebami in identificirali 256 oziroma 552 različno izraženih beljakovin pri nemalinskih miopatijah ACTA1 in TNNT1 (slika 6E–G in dopolnilna slika 11C, dodatni nabor podatkov 21). Analiza obogatitve genov je pokazala usklajeno zmanjšanje mitohondrijskih beljakovin (slika 6H–I, dodatni nabor podatkov 22). Presenetljivo je bilo to zmanjšanje kljub različni prevladi tipov vlaken pri nemalinskih miopatijah ACTA1 in TNNT1 popolnoma neodvisno od tipa vlaken na osnovi MYH (slika 6H in dodatne slike 11D–I, dodatni nabor podatkov 23). Pri nemalinskih miopatijah ACTA1 ali TNNT1 so bile regulirane tudi tri mikrobne beljakovine. Dva od teh mikroproteinov, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (znan tudi kot LINC00598 ali Lnc-FOXO1) in ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), sta pokazala različno številčnost le v miofibrih tipa 1. Predhodno je bilo ugotovljeno, da ima ENSG00000215483_TR14_ORF67 vlogo pri regulaciji celičnega cikla.56 Po drugi strani pa je bila količina ENSG00000232046_TR1_ORF437 (ki ustreza LINC01798) povečana v miofibrih tipa 1 in tipa 2A pri ACTA1-nemalinski miopatiji v primerjavi z zdravimi kontrolami (dodatna slika 12A, dodatni nabor podatkov 24). Nasprotno pa ribosomske beljakovine niso bile v veliki meri prizadete zaradi nemalinske miopatije, čeprav je bil RPS17 pri nemalinski miopatiji ACTA1 zmanjšano izražen (slika 6E).
Analiza obogatitve je prav tako pokazala povečano regulacijo procesov imunskega sistema pri nemalinskih miopatijah ACTA1 in TNNT1, medtem ko se je celična adhezija povečala tudi pri nemalinski miopatiji TNNT1 (slika 6H). Obogatitev teh zunajceličnih faktorjev se je odražala v tem, da so zunajcelične matriksne beljakovine premaknile PCA v PC1 in PC2 v negativno smer (tj. proti najbolj prizadetim vlaknom) (slika 6J). Obe skupini bolnikov sta pokazali povečano izražanje zunajceličnih beljakovin, ki sodelujejo pri imunskih odzivih in mehanizmih popravljanja sarkoleme, kot so aneksini (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 in njihova interakcijska beljakovina S100A1159 (dodatne slike 12B–C). Ta proces je bil že prej opisan kot okrepljen pri mišičnih distrofijah60, vendar po našem vedenju prej ni bil povezan z nemalinskimi miopatijami. Normalno delovanje tega molekularnega mehanizma je potrebno za popravilo sarkoleme po poškodbi in za fuzijo novo nastalih miocitov z miofibrili58,61. Tako povečana aktivnost tega procesa v obeh skupinah bolnikov kaže na reparativni odziv na poškodbo, ki jo povzroča nestabilnost miofibrin.
Učinki vsake nemalinske miopatije so bili dobro korelirani (r = 0,736) in so pokazali razumno prekrivanje (dodatni sliki 11A–B), kar kaže, da imata nemalinska miopatija ACTA1 in TNNT1 podobne učinke na proteom. Vendar pa so bili nekateri proteini regulirani le pri nemalinski miopatiji ACTA1 ali TNNT1 (dodatni sliki 11A in C). Profibrotični protein MFAP4 je bil eden najbolj povečano reguliranih proteinov pri nemalinski miopatiji TNNT1, vendar je ostal nespremenjen pri nemalinski miopatiji ACTA1. SKIC8, komponenta kompleksa PAF1C, odgovorna za regulacijo transkripcije gena HOX, je bila pri nemalinski miopatiji TNNT1 zmanjšano regulirana, vendar pri nemalinski miopatiji ACTA1 ni bila prizadeta (dodatna slika 11A). Neposredna primerjava nemalinske miopatije ACTA1 in TNNT1 je pokazala večje zmanjšanje mitohondrijskih beljakovin in povečanje beljakovin imunskega sistema pri nemalinski miopatiji TNNT1 (slika 6G–H in dodatni sliki 11C in 11H–I). Ti podatki so skladni z večjo atrofijo/distrofijo, opaženo pri nemalinski miopatiji TNNT1 v primerjavi z nemalinsko miopatijo TNNT1 (slika 6A), kar kaže na to, da nemalinska miopatija TNNT1 predstavlja hujšo obliko bolezni.
Da bi ocenili, ali opaženi učinki nemalinske miopatije vztrajajo na ravni celotne mišice, smo izvedli množično proteomsko analizo mišičnih biopsij iste kohorte bolnikov z nemalinsko miopatijo TNNT1 in jih primerjali s kontrolno skupino (n=3 na skupino) (dodatna slika 13A, dodatni nabor podatkov 25). Kot je bilo pričakovano, so bile kontrolne skupine v analizi glavnih komponent tesno povezane, medtem ko so bolniki z nemalinsko miopatijo TNNT1 pokazali večjo medvzorčno variabilnost, podobno kot pri analizi posameznih vlaken (dodatna slika 13B). Množična analiza je reproducirala različno izražene beljakovine (dodatna slika 13C, dodatni nabor podatkov 26) in biološke procese (dodatna slika 13D, dodatni nabor podatkov 27), ki so bili poudarjeni s primerjavo posameznih vlaken, vendar je izgubila sposobnost razlikovanja med različnimi tipi vlaken in ni upoštevala heterogenih učinkov bolezni na vlakna.
Ti podatki skupaj kažejo, da lahko proteomika posameznih miofibril razjasni klinične biološke značilnosti, ki jih ni mogoče zaznati s ciljno usmerjenimi metodami, kot je imunobloting. Poleg tega ti podatki poudarjajo omejitve uporabe same tipizacije aktinskih vlaken (MYH) za opis fenotipske prilagoditve. Dejansko se preklapljanje tipov vlaken med aktinskima in troponinskima nemalinskimi miopatijami razlikuje, obe nemalinski miopatiji ločujeta tipizacijo vlaken MYH od presnove skeletnih mišičnih vlaken v smeri hitrejšega in manj oksidativnega mišičnega proteoma.
Celična heterogenost je ključnega pomena za to, da tkiva izpolnjujejo svoje raznolike potrebe. V skeletnih mišicah se to pogosto opisuje kot tipi vlaken, za katere so značilne različne stopnje produkcije sile in utrujenosti. Vendar je jasno, da to pojasnjuje le majhen del variabilnosti vlaken skeletnih mišic, ki je veliko bolj spremenljiva, kompleksna in večplastna, kot se je prej mislilo. Tehnološki napredek je zdaj osvetlil dejavnike, ki uravnavajo vlakna skeletnih mišic. Dejansko naši podatki kažejo, da vlakna tipa 2X morda niso ločen podtip vlaken skeletnih mišic. Poleg tega smo kot glavne dejavnike heterogenosti vlaken skeletnih mišic identificirali presnovne beljakovine, ribosomske beljakovine in beljakovine, povezane s celicami. Z uporabo našega proteomskega poteka dela na vzorcih bolnikov z nematodno miopatijo smo dodatno dokazali, da tipizacija vlaken na osnovi MYH ne odraža v celoti heterogenosti skeletnih mišic, zlasti kadar je sistem moten. Dejansko ne glede na tip vlaken na osnovi MYH nematodna miopatija povzroči premik k hitrejšim in manj oksidativnim vlaknom.
Vlakna skeletnih mišic so bila razvrščena že od 19. stoletja. Nedavne omik analize so nam omogočile, da smo začeli razumevati profile izražanja različnih tipov vlaken MYH in njihove odzive na različne dražljaje. Kot je opisano tukaj, imajo omik pristopi tudi prednost večje občutljivosti za kvantifikacijo označevalcev tipov vlaken kot tradicionalne metode, ki temeljijo na protitelesih, ne da bi se zanašali na kvantifikacijo enega samega (ali nekaj) označevalcev za opredelitev tipa vlaken skeletnih mišic. Uporabili smo komplementarne transkriptomske in proteomske poteke dela ter integrirali rezultate, da bi preučili transkripcijsko in posttranskripcijsko regulacijo heterogenosti vlaken v človeških skeletnih mišičnih vlaknih. Ta potek dela je povzročil, da ni bilo mogoče identificirati čistih vlaken tipa 2X na ravni beljakovin v mišici vastus lateralis naše kohorte zdravih mladih moških. To je skladno s prejšnjimi študijami posameznih vlaken, ki so v zdravih mišicah vastus lateralis odkrile <1 % čistih vlaken 2X, čeprav bi to morali v prihodnosti potrditi tudi v drugih mišicah. Razlika med detekcijo skoraj čistih vlaken 2X na ravni mRNA in le mešanih vlaken 2A/2X na ravni beljakovin je presenetljiva. Ekspresija mRNA izooblike MYH ni cirkadiana,67 kar kaže na to, da verjetno nismo »zgrešili« signala začetka MYH2 v na videz čistih vlaknih 2X na ravni RNA. Ena od možnih razlag, čeprav zgolj hipotetična, bi lahko bile razlike v stabilnosti beljakovin in/ali mRNA med izooblikami MYH. Dejansko nobeno hitro vlakno ni 100 % čisto za katero koli izoobliko MYH in ni jasno, ali bi ravni ekspresije mRNA MYH1 v območju 70–90 % povzročile enako številčnost MYH1 in MYH2 na ravni beljakovin. Vendar pa lahko pri obravnavi celotnega transkriptoma ali proteoma analiza grozdov zanesljivo identificira le dva različna grozda, ki predstavljata počasna in hitra vlakna skeletnih mišic, ne glede na njihovo natančno sestavo MYH. To je skladno z analizami, ki uporabljajo transkriptomske pristope z enim jedrom, ki običajno identificirajo le dva različna mionuklearna grozda. 68, 69, 70 Poleg tega, čeprav so prejšnje proteomske študije identificirale vlakna tipa 2X, se ta vlakna ne združujejo ločeno od preostalih hitrih vlaken in kažejo le majhno število različno bogatih beljakovin v primerjavi z drugimi tipi vlaken na podlagi MYH. 14 Ti rezultati kažejo, da bi se morali vrniti k pogledu na klasifikacijo mišičnih vlaken iz začetka 20. stoletja, ki je vlakna človeških skeletnih mišic delil ne v tri različne razrede na podlagi MYH, temveč v dva grozda na podlagi njihovih presnovnih in kontraktilnih lastnosti. 63
Še pomembneje je, da je treba heterogenost mišičnih vlaken obravnavati v več dimenzijah. Prejšnje študije »omike« so pokazale v to smer in nakazovale, da vlakna skeletnih mišic ne tvorijo ločenih grozdov, temveč so razporejena vzdolž kontinuuma. 11, 13, 14, 64, 71 Tukaj prikazujemo, da se poleg razlik v kontraktilnih in presnovnih lastnostih skeletnih mišic mišična vlakna lahko razlikujejo tudi po značilnostih, povezanih z interakcijami med celicami in mehanizmi prevajanja. Dejansko smo v vlaknih skeletnih mišic odkrili heterogenost ribosomov, ki prispeva k heterogenosti neodvisno od počasnih in hitrih vrst vlaken. Osnovni vzrok za to znatno heterogenost mišičnih vlaken, neodvisno od počasnih in hitrih vrst vlaken, ostaja nejasen, vendar lahko kaže na specializirano prostorsko organizacijo znotraj mišičnih snopov, ki se optimalno odzivajo na specifične sile in obremenitve,72 specializirano celično ali organsko specifično komunikacijo z drugimi vrstami celic v mišičnem mikrookolju73,74,75 ali razlike v aktivnosti ribosomov znotraj posameznih mišičnih vlaken. Dejansko se je izkazalo, da je ribosomska heteroplazmija, bodisi s paralogno substitucijo RPL3 in RPL3L bodisi na ravni 2'O-metilacije rRNA, povezana s hipertrofijo skeletnih mišic76,77. Večomske in prostorske aplikacije v kombinaciji s funkcionalno karakterizacijo posameznih mišičnih vlaken bodo še izboljšale naše razumevanje mišične biologije na večomski ravni78.
Z analizo proteomov posameznih miofibril pri bolnikih z nemalinskimi miopatijami smo pokazali tudi uporabnost, učinkovitost in uporabnost proteomike posameznih miofibril za razjasnitev klinične patofiziologije skeletnih mišic. Poleg tega smo s primerjavo našega poteka dela z globalno proteomsko analizo lahko dokazali, da proteomika posameznih miofibril daje enako globino informacij kot globalna tkivna proteomika in to globino razširja z upoštevanjem heterogenosti med vlakni in tipa miofibril. Poleg pričakovanih (čeprav spremenljivih) razlik v razmerju tipov vlaken, opaženih pri nemalinskih miopatijah ACTA1 in TNNT1 v primerjavi z zdravimi kontrolnimi osebami,19 smo opazili tudi oksidativno in zunajcelično preoblikovanje neodvisno od preklapljanja tipov vlaken, ki ga povzroča MYH. Fibroza je bila že prej opisana pri TNNT1 nemalinskih miopatijah.19 Vendar pa naša analiza gradi na tej ugotovitvi, saj razkriva tudi povečane ravni zunajceličnih izločenih stresnih beljakovin, kot so aneksini, ki sodelujejo pri mehanizmih popravljanja sarkoleme, v miofibrih bolnikov z ACTA1 in TNNT1 nemalinskimi miopatijami.57,58,59 Skratka, povečane ravni aneksina v miofibrih bolnikov z nemalinsko miopatijo lahko predstavljajo celični odziv za popravilo hudo atrofičnih miofibr.
Čeprav ta študija predstavlja največjo analizo celotne mišične omike pri ljudeh doslej, ni brez omejitev. Skeletna mišična vlakna smo izolirali iz relativno majhnega in homogenega vzorca udeležencev ter ene same mišice (vastus lateralis). Zato ni mogoče izključiti obstoja specifičnih populacij vlaken v različnih mišičnih tipih in na skrajnih mejah mišične fiziologije. Na primer, ne moremo izključiti možnosti, da se podmnožica ultrahitrih vlaken (npr. čista 2X vlakna) pojavi pri visoko treniranih šprinterjih in/ali močnih športnikih79 ali v obdobjih mišične neaktivnosti66,80. Poleg tega nam je omejena velikost vzorca udeležencev preprečila, da bi raziskali spolne razlike v heterogenosti vlaken, saj je znano, da se razmerja tipov vlaken med moškimi in ženskami razlikujejo. Poleg tega nismo mogli izvesti transkriptomskih in proteomskih analiz na istih mišičnih vlaknih ali vzorcih istih udeležencev. Ker mi in drugi še naprej optimiziramo analize posameznih celic in posameznih miofibrin z uporabo omične analize za doseganje ultra nizkega vnosa vzorca (kot je prikazano tukaj pri analizi vlaken bolnikov z mitohondrijsko miopatijo), postaja očitna možnost kombiniranja večomičnih (in funkcionalnih) pristopov znotraj posameznih mišičnih vlaken.
Naši podatki na splošno identificirajo in pojasnjujejo transkripcijske in posttranskripcijske dejavnike heterogenosti skeletnih mišic. Natančneje, predstavljamo podatke, ki izpodbijajo dolgoletno dogmo v fiziologiji skeletnih mišic, povezano s klasično definicijo tipov vlaken, ki temelji na MYH. Upamo, da bomo obnovili razpravo in na koncu ponovno premislili o našem razumevanju klasifikacije in heterogenosti vlaken skeletnih mišic.
Štirinajst belopoltih udeležencev (12 moških in 2 ženski) se je prostovoljno strinjalo s sodelovanjem v tej študiji. Študijo je odobril Etični odbor Univerzitetne bolnišnice Ghent (BC-10237), bila je v skladu s Helsinško deklaracijo iz leta 2013 in je bila registrirana pri ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Splošne značilnosti udeležencev so predstavljene v dodatni tabeli 1. Po pridobitvi ustnega in pisnega informiranega soglasja so udeleženci pred končno vključitvijo v študijo opravili zdravniški pregled. Udeleženci so bili mladi (22–42 let), zdravi (brez zdravstvenih težav, brez kajenja) in zmerno telesno aktivni. Maksimalni privzem kisika je bil določen z uporabo step ergometra za oceno telesne pripravljenosti, kot je opisano že prej. 81
Vzorce mišične biopsije smo odvzeli v mirovanju in na tešče trikrat, v razmiku 14 dni. Ker so bili ti vzorci odvzeti v okviru večje študije, so udeleženci 40 minut pred biopsijo zaužili placebo (laktozo), antagonist receptorjev H1 (540 mg feksofenadina) ali antagonist receptorjev H2 (40 mg famotidina). Predhodno smo dokazali, da ti antagonisti histaminskih receptorjev ne vplivajo na telesno pripravljenost skeletnih mišic v mirovanju81, in na naših grafih kontrole kakovosti nismo opazili nobenega združevanja, povezanega s stanjem (dodatni sliki 3 in 6). Standardizirana prehrana (41,4 kcal/kg telesne teže, 5,1 g ogljikovih hidratov/kg telesne teže, 1,4 g beljakovin/kg telesne teže in 1,6 g maščobe/kg telesne teže) se je vzdrževala 48 ur pred vsakim poskusnim dnem, standardiziran zajtrk (1,5 g ogljikovih hidratov/kg telesne teže) pa je bil zaužit zjutraj na poskusni dan. V lokalni anesteziji (0,5 ml 1 % lidokaina brez adrenalina) so bili odvzeti mišični biopsiji iz mišice vastus lateralis s perkutano Bergströmovo aspiracijo.82 Vzorci mišic so bili takoj vgrajeni v RNAlater in shranjeni pri 4 °C do ročne disekcije vlaken (do 3 dni).
Sveže izolirane snope mišičnih vlaken smo prenesli v svež medij RNAlater v kultivacijski posodi. Posamezna mišična vlakna smo nato ročno secirali s stereomikroskopom in fino pinceto. Iz vsake biopsije smo secirali petindvajset vlaken, pri čemer smo posebno pozornost namenili izbiri vlaken z različnih področij biopsije. Po disekciji smo vsako vlakno nežno potopili v 3 μl liznega pufra (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad), ki je vseboval encima proteinaza K in DNaza, da smo odstranili neželene beljakovine in DNK. Celično lizo in odstranitev beljakovin/DNK smo nato sprožili s kratkim mešanjem v vrtincu, vrtenjem tekočine v mikrocentrifugi in inkubacijo pri sobni temperaturi (10 min). Lizat smo nato inkubirali v termociklerju (T100, Bio-Rad) pri 37 °C 5 minut, 75 °C 5 minut in nato takoj shranili pri -80 °C do nadaljnje obdelave.
Z Illumino združljive poliadenilirane RNA knjižnice so bile pripravljene iz 2 µl lizata miofiber z uporabo kompleta QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Podrobne metode najdete v navodilih proizvajalca. Postopek se začne s sintezo cDNA prve verige z reverzno transkripcijo, med katero se vnesejo edinstveni molekularni identifikatorji (UMI) in vzorcu specifične črtne kode i1, da se zagotovi združevanje vzorcev in zmanjša tehnična variabilnost med nadaljnjo obdelavo. cDNA iz 96 miofiber se nato združi in očisti z magnetnimi kroglicami, nakar se RNA odstrani in se izvede sinteza druge verige z uporabo naključnih primerjev. Knjižnica se očisti z magnetnimi kroglicami, dodajo se oznake i5/i7, specifične za pool, in se PCR pomnoži. Končni korak čiščenja ustvari knjižnice, združljive z Illumino. Kakovost vsakega poola knjižnice je bila ocenjena z uporabo kompleta za analizo DNA z visoko občutljivostjo majhnih fragmentov (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Na podlagi kvantifikacije s kubitom so bili združeni vzorci nadalje združeni pri ekvimolarnih koncentracijah (2 nM). Nastali združeni vzorci so bili nato sekvencirani na instrumentu NovaSeq 6000 v standardnem načinu z uporabo kompleta reagentov NovaSeq S2 (1 × 100 nukleotidov) z obremenitvijo 2 nM (4 % PhiX).
Naš cevovod temelji na Lexogenovem cevovodu za analizo podatkov QuantSeq Pool (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Podatki so bili najprej demultipleksirani z bcl2fastq2 (v2.20.0) na podlagi indeksa i7/i5. Drugi odčitek je bil nato demultipleksiran z idemux (v0.1.6) na podlagi vzorčne črtne kode i1, zaporedja UMI pa so bila ekstrahirana z umi_tools (v1.0.1). Odčitki so bili nato v več krogih obrezani z cutadapt (v3.4), da so bili odstranjeni kratki odčitki (dolžine <20) ali odčitki, ki so bili sestavljeni izključno iz adapterskih zaporedij. Odčitki so bili nato poravnani s človeškim genomom z uporabo STAR (v2.6.0c), datoteke BAM pa so bile indeksirane s SAMtools (v1.11). Podvojeni odčitki so bili odstranjeni z uporabo umi_tools (v1.0.1). Nazadnje je bilo štetje poravnav izvedeno z uporabo featureCounts v Subread (v2.0.3). Kontrola kakovosti je bila izvedena z uporabo programa FastQC (v0.11.9) na več vmesnih stopnjah cevovoda.
Vsa nadaljnja bioinformatska obdelava in vizualizacija sta bili izvedeni v jeziku R (v4.2.3), predvsem z uporabo delovnega toka Seurat (v4.4.0).83 Zato so bile posamezne vrednosti UMI in matrike metapodatkov pretvorjene v objekte Seurat. Odstranjeni so bili geni, izraženi v manj kot 30 % vseh vlaken. Vzorci nizke kakovosti so bili odstranjeni na podlagi minimalnega praga 1000 vrednosti UMI in 1000 zaznanih genov. Na koncu je 925 vlaken prestalo vse korake filtriranja nadzora kakovosti. Vrednosti UMI so bile normalizirane z metodo Seurat SCTransform v2,84 vključno z vsemi 7418 zaznanimi značilnostmi, razlike med udeleženci pa so bile regresirano odpravljene. Vse ustrezne metapodatke najdete v dodatnem naboru podatkov 28.